Transformación plásmido CNTN1

Es segueix el protocol de Stratagene: XL10-Gold Ultracompetent cells.  Cat nº: 200314

• Posar en gel 3 tubs falcon de bacteris (amb doble tancament) à control positiu, control negatiu i CNTN1 (EX-A1153-M02 Genecopoeia, resistència ampicil·lina)
• Descongelar les cèl·lules competents en gel (es troben a -80ºC)
• Treure del congelador (del kit) el βmercaptoetanol* (tap verd) i el pUC18 (DNA del control positiu, tap blau).
• Afegir 100 µL de cèl·lules a cada tub: als tubs de control positiu i control negatiu es pot posar menys quantitat
• Afegir 4 µL de βME a cada tub
• Incubar 10 minuts en gel i anar barrejant cada dos minuts (suaument).
• Afegir el DNA als tubs (cada DNA al tub corresponent):
  • pUC18 (control positiu): afegir 1 µL
  • CNTN1: 50 ng (el plàsmid estava a 325 ng/ul, així que faig una dilució 1/10 amb aigua estèril i poso 1,54ul)
• Incubar 30 minuts en gel

*durant aquesta estona, escalfar l’agitador orbital (37ºC) i el bany humit (42ºC)à preescalfar un tub de LB a 42ºC

• Posar els tubs 30 segons al bany humit a 42ºC (pas crític!!!)
• Posar en gel 2 minuts
• Afegir 0,8 ml de LB preescalfat a cada tub.
• Incubar 1 hora a 37ºC agitant a 225-250 rpm (agitador orbital)
• Plaquejar: posar a cada placa de 50 a 150 µL de la solució i escampar amb una nansa (pipeta Pasteur de vidre amb la punta tancada i doblegada amb el bunsen).

Es fan 4 plaques d’ampicil·lina (si estaven a la nevera, s’han d’atemperar una estona a Tambient abans d’utilitzar-les):

• Control positiu: 100 µL
  • Control negatiu: 100 µL
  • CNTN1:  50 µL, 100 µL
• Incubar tota la nit a 37ºC (a l’estufa)

08/02/2024

Starter CNTN1, FLOT1 y FLOT2

• CNTN1 (EX-A1153-M02 Genecopoeia, resistència ampicil·lina):
  • A primera hora: picar algunes colònies per fer-les créixer à s’escullen 2 colònies que estiguin ben aïllades
  • Amb una punta de pipeta mitjana agafar una colònia aïllada
  • Posar-la a un tub falcon de bacteris amb 5 mL de LB + ampicil·lina 1/1000 à deixar anar la punta dins del tub i deixar-la allà.
• FLOT1 (NM_005803 Origene, resistència ampi) i FLOT2 (EX-H1820-M02 Genecopoeia, resistència ampi):
  • El Starter es fa a partir d’un glicerolat à sense deixar que el glicerolat es descongeli (recollir del congelador en gel), raspar la mostra de glicerolat afegir dins el tub amb LB + ampicil·lina 1/1000
• Deixar unes hores a 37ºC agitant a 225-250 rpm (agitador orbital)
• Passades unes 6 hores, abocar l’starter prèviament seleccionat a un erlenmeyer amb 250ml de LB + ampicil·lina 1/1000
• Incubar overnight a 37 ºC en agitació (agitador orbital)
• A l’endemà, amb una part del cultiu continuar amb el protocol per a maxi-preps, i amb l’altra preparar un glicerolat (en aquest cas no s’han preparat glicerolats perquè ja hi havia).

09/02/2024

HiSpeed Plasmid Maxi Kit

• Centrifugar el cultiu a 6000G durant 15 minuts a 4ºC (ultracentrifuga Bioquímica planta 3 IR).
• Resuspendre el pellet en 10 ml de Buffer P1.
• Afegir 10ml de Buffer P2, barrejar-ho per inversió i incubar 5 minuts
• Durant la incubació, posar el tap del QIAfilterCartridge.
• Afegir 10ml de Buffer P3 al lisat i barrejar-ho immediatament
• Abocar el lisat al QIA filterCartridge i incuba-ho a temperatura ambient durant 10 minuts.
• Equilibrar un HiSpeed Tip amb 10 ml de Buffer QBT.
• Treure el tap del QIAfilterCartidge i gradualment insertar l’èmbol i filtrar el lisat cel·lular al HiSpeed Tip equilibrat.
• Un cop el lisat ha entrat, rentar el HiSpeed Tip amb 60ml de Buffer QC.
• Eluir el DNA amb 15ml de Buffer QF en tubs de 50 ml.
• Precipitar el DNA afegint 10,5 ml d’isopropanol, barrejar-ho i incubar-ho 5 minuts.
• Durant la incubació treure l’èmbol d’una xeringa i posar-li el QIAprecipitatorModule.
• Posar el QIAprecipitator damunt d’una ampolla de deixalles, transferir la solució d’eluat amb isopropanol i posar-hi l’èmbol.
• Filtrar la barreja amb el QIAprecipitator utilitzant una pressió constant.
• Treure el QIAprecipitator de la xeringa i treure l’èmbol.
• Tornar a posar el QIAprecipitator i afegir 2ml d’etanol 70% a la xeringa.
• Rentar el DNA posant l’èmbol i fent passar l’etanol pel QIAprecipitator.
• Treure el QIAprecipitator de la xeringa i treure l’èmbol. Posar el QIAprecipitator un altre cop i posar l’èmbol. Assecar la membrana fent passar aire a través del QIAprecipitator enèrgicament. Repetir aquest pas diverses vegades.
• Assecar la punta del QIAprecipitator amb paper adsorvent.
• Treure l’èmbol d’una xeringa nova de 5ml i posa-hi el QIAprecipitator.
• Afegir 0,5ml de Buffer TE a la xeringa i posa-hi l’èmbol eluint el DNA en un tub fent servir pressió constant.
• Treure el QIAprecipitator de la xeringa, treure l’èmbol i tornar a posar el QIAprecipitator.
• Transferir l’eluit a la xeringa i torna-ho a eluir al mateix tub.
• Mesurar la quantitat de DNA amb l’espectofotòmetre i guardar el tub a la nevera 4ºC.
  • [CNTN1]: 396 ng/ul
  • [FLOT1]: 272 ng/ul
  • [FLOT2]: 363 ng/ul