Muestras:
- 23-2-1110: titulación y subclases CASPR1
- 23-409048 (23-2-1331): titulación y subclases CASPR1
- 136-8: subclases CASPR1
- 22-2-374: subclases CASPR1
Protocolo:
- Bloquear con leche 5% en PBS-tween 0’1% : 200 ul pozo (incubar 1h a temp. ambiente)
- Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
- Diluir los sueros:
- Titulación: preparar un tubo con 400 ul de suero diluído 1/100 en leche 5%, y poner en 5 tubos 280 ul de leche 5%. Pasar 140 ul de dilución del primer tubo al 2º tubo, y así sucesivamente hasta obtener las 6 diluciones (a: 1/100, b:1/300, c:1/900, d: 1/2700, e: 1/8100 i f: 1/24300)
- Subclases y screening: diluir sueros 1/100 en leche 5% en PBS-tween 0’1%
- Incubar con los sueros 1h a RT
- Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
- Ac secundarios:
- Titulación / screening / confirmación: Incubar con RAH IgG HRP 1/3000 en leche 5% en PBS-tween 0’1% : 100 ul/pozo, 45 min
- Subclases: Incubar con MAH HRP* IgG1 o IgG2 o IgG3 o IgG4 1/500 en leche 5% en PBS-tween 0’1%: 100 ul/pozo, 45 min
- Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
- Incubar 5min con TMB: preparar solución un rato antes y tapar de la luz (para que se atempere) : 100 ul/pozo
- Parar la reacción con 50ul de H2SO4 25%
- Leer a 450-570 nm
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A prot | 23-2-1110 1/100 | 23-2-1110 1/8100 | 23-2-1331 1/900 | 23-2-1110 IgG1 | 23-2-1331 IgG1 | 136-8 IgG1 | 22-2-374 IgG1 | 136-8 IgGtot | ||||
| B blanc | 23-2-1110 1/100 | 23-2-1110 1/8100 | 23-2-1331 1/900 | 23-2-1110 IgG1 | 23-2-1331 IgG1 | 136-8 IgG1 | 22-2-374 IgG1 | 136-8 IgGtot | ||||
| C prot | 23-2-1110 1/300 | 23-2-1110 1/24300 | 23-2-1331 1/2700 | 23-2-1110 IgG2 | 23-2-1331 IgG2 | 136-8 IgG2 | 22-2-374 IgG2 | 22-2-374 IgGtot | ||||
| D blanc | 23-2-1110 1/300 | 23-2-1110 1/24300 | 23-2-1331 1/2700 | 23-2-1110 IgG2 | 23-2-1331 IgG2 | 136-8 IgG2 | 22-2-374 IgG2 | 22-2-374 IgGtot | ||||
| E prot | 23-2-1110 1/900 | 23-2-1331 1/100 | 23-2-1331 1/8100 | 23-2-1110 IgG3 | 23-2-1331 IgG3 | 136-8 IgG3 | 22-2-374 IgG3 | Cneg IgGtot | ||||
| F blanc | 23-2-1110 1/900 | 23-2-1331 1/100 | 23-2-1331 1/8100 | 23-2-1110 IgG3 | 23-2-1331 IgG3 | 136-8 IgG3 | 22-2-374 IgG3 | Cneg IgGtot | ||||
| G prot | 23-2-1110 1/2700 | 23-2-1331 1/300 | 23-2-1331 1/24300 | 23-2-1110 IgG4 | 23-2-1331 IgG4 | 136-8 IgG4 | 22-2-374 IgG4 | |||||
| Hblanc | 23-2-1110 1/2700 | 23-2-1331 1/300 | 23-2-1331 1/24300 | 23-2-1110 IgG4 | 23-2-1331 IgG4 | 136-8 IgG4 | 22-2-374 IgG4 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A prot | 0,078 | 0,042 | 0,136 | 0,188 | 0,177 | 0,596 | 0,936 | 0,681 | ||||
| B blanc | 0,036 | 0,046 | 0,063 | 0,108 | 0,152 | 0,144 | 0,148 | 0,053 | ||||
| C prot | 0,055 | 0,041 | 0,099 | 0,132 | 0,274 | 0,129 | 0,157 | 0,837 | ||||
| D blanc | 0,069 | 0,039 | 0,064 | 0,092 | 0,13 | 0,11 | 0,158 | 0,057 | ||||
| E prot | 0,053 | 0,56 | 0,067 | 0,035 | -0,02 | 0,086 | 0,06 | 0,064 | ||||
| F blanc | 0,057 | 0,051 | 0,049 | 0,04 | 0,225 | 0,038 | 0,028 | 0,055 | ||||
| G prot | 0,063 | 0,272 | 0,059 | 0,065 | 0,143 | 0,25 | 0,192 | |||||
| Hblanc | 0,043 | 0,034 | 0,051 | 0,025 | 0,051 | 0,03 | 0,046 |
Resultado: El ELISA no ha salido muy alto (en el ELISA del 10/11/2023 el C+ 136-8 salió 1,1 con IgG totales, y en este ha salido 0,681… así que todo estará un poco más bajo). Además, compro un nuevo anticuerpo IgG4 porque sale muy bajo (a partir de ahora alicuotar y guardar a -20, no ir sacando cada vez el mismo tubo)
- 23-2-1110: no salen ni las subclases ni la titulación… envío informe como título 1/300 (titulación hecha el día 10/11/2023), y subclase IgG4 à REPETIR igualmente
- 23-409048 (23-2-1331): título CASPR1 1/900, subclases predominantes: IgG2, IgG4
- 136-8: subclases IgG1, IgG4 à debería salir también IgG3!!!
- 22-2-374: subclases IgG1, IgG4 à debería salir también IgG3!!
*Marta ha hecho ELISA de subclases de CNTN1 la semana anterior y le salen dos pacientes claramente IgG3, así que el anticuerpo secundario funciona bien. Repetir todo este ELISA sacando alícuotas nuevas de todos los sueros (probar de hacerlo en las placas antiguas y sin congelar, ya que en el paper de Elba salían las OD de los Caspr1 mucho más altas). Concentrar más el anticuerpo RAHIgGtotales.
