2023.11.27: ELISA NF186 (titulación y subclases)

Muestras:

• 23-2-1183: muestra panNF+. Titulación y subclases NF186
• Cneg 217-30
• Cpos RDP

Protocolo:

• Bloquear con leche 5% en PBS-tween 0’1% : 200 ul pozo (incubar 1h a temp. ambiente)
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Diluir los  sueros:
  • Titulación: preparar un tubo con 400 ul de suero diluído 1/100 en leche 5%, y poner en 5 tubos 280 ul de leche 5%. Pasar 140 ul de dilución del primer tubo al 2º tubo, y así sucesivamente hasta obtener las 6 diluciones (a: 1/100, b:1/300, c:1/900, d: 1/2700, e: 1/8100 i f: 1/24300)
  • Subclases y screening:  diluir sueros 1/100 en leche 5% en PBS-tween 0’1%
• Incubar con los sueros 1h a RT
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Ac secundarios:
  • Titulación / screening / confirmación: Incubar con RAH IgG HRP 1/3000 en leche 5% en PBS-tween 0’1% : 100 ul/pozo, 45 min
  • Subclases: Incubar con MAH HRP* IgG1 o IgG2 o IgG3 o IgG4 1/500 en leche 5% en PBS-tween 0’1%: 100 ul/pozo, 45 min
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Incubar 5min con TMB: preparar solución un rato antes y tapar de la luz (para que se atempere) : 100 ul/pozo
• Parar la reacción con 50ul de H₂SO₄ 25%
• Leer a 450-570 nm

Resultado:

• 23-2-1183: título NF186 1/2700. Subclase predominante IgG4 >> IgG1