Plásmido B3GAT1 []= 100 ng/ul, resistencia a ampicilina
Transformació E.Coli
Es segueix el protocol de Stratagene: XL10-Gold Ultracompetent cells. Cat nº: 200314
Tot el procés es fa a les cabines de cultius de bacteris
- Posar en gel 3 tubs falcon de bacteris (amb doble tancament) à control positiu, control negatiu, control positiu i B3GAT1
- Descongelar les cèl·lules competents en gel (es troben a -80ºC)
- Treure del congelador (del kit) el βmercaptoetanol (tap verd) i el pUC18 (DNA del control positiu, tap blau). *El control positiu pUC18 només es pot utilitzar amb plaques d’ampicil·lina
- Afegir 100 µL de cèl·lules a cada tub
- Afegir 4 µL de βME a cada tub
- Incubar 10 minuts en gel i anar barrejant cada dos minuts (suaument).
- Afegir el DNA als tubs (cada DNA al tub corresponent):
- pUC18 (control positiu): afegir 1 µL
- B3GAT1: afegir 0’1 – 50 ng à afegeixo 0,5 ul de plàsmid (50 ng).
- Incubar 30 minuts en gel
*durant aquesta estona, escalfar l’agitador orbital (37ºC) i el bany humit (42ºC)à preescalfar un tub de LB a 42ºC
- Posar els tubs 30 segons al bany humit a 42ºC (pas crític!!!)
- Posar en gel 2 minuts
- Afegir 0,8 ml de LB preescalfat a cada tub.
- Incubar 1 hora a 37ºC agitant a 225-250 rpm (agitador orbital)
- Plaquejar: posar a cada placa uns µL de la solució i escampar amb una nansa
- En aquest cas, es fan 4 plaques (s’han d’atemperar una estona a Tambient):
- Control positiu: 100 µL
- Control negatiu: 100 µL
- B3GAT1: 50 µL, 100 µL
- Incubar tota la nit a 37ºC (a l’estufa, plaques boca abaix)
14/11/2023
Starter plàsmid B3GAT1
A primera hora: picar algunes colònies de les plaques amb B3GAT1 per fer-les créixer (cabina de bacteris).
- S’escullen 2 colònies que estiguin ben aïllades (encerclar amb rotulador).
- Amb una punta de pipeta mitjana agafar una colònia aïllada
- Posar-la a un tub falcon de bacteris amb 5 mL de LB + ampicil·lina 1/1000 à deixar anar la punta dins del tub i deixar-la allà.
- Deixar unes hores a 37ºC agitant a 225-250 rpm (agitador orbital)
- Preparar un erlenmeyer de 250 mL de medi LB amb ampicil·lina 1/1000
- A última hora de la tarda abocar l’starter prèviament seleccionat a l’erlenmeyer.
- Incubar overnight a 37 ºC en agitació (agitador orbital)
15/11/2023
Maxiprep plásmido B3GAT1
Seguir el protocol del kit HiSpeed Plasmid Maxi Kit:
- Centrifugar el cultiu a 6000G durant 15 minuts a 4ºC (ultracentrífuga 3a planta).
- Resuspendre el pellet en 10 ml de Buffer P1 (aquest és l’únic pas que cal fer a la cabina de bacteris)
- Afegir 10ml de Buffer P2, barrejar-ho per inversió i incubar-ho fins que la solució es torni blava (aproximadament 5 minuts).
- Durant la incubació, posar el tap del QIAfilterCartridge.
- Afegir 10ml de Buffer P3 al lisat i barrejar-ho immediatament fins que la solució sigui completament incolora.
- Abocar el lisat al QIA filterCartridge i incuba-ho a temperatura ambient durant 10 minuts.
- Equilibrar un HiSpeed Tip amb 10 ml de Buffer QBT.
- Treure el tap del QIAfilterCartidge i gradualment insertar l’èmbol i filtrar el lisat cel·lular al HiSpeed Tip equilibrat.
- Un cop el lisat ha entrat, rentar el HiSpeed Tip amb 60ml de Buffer QC.
- Eluir el DNA amb 15ml de Buffer QF en tubs de 50 ml.
- Precipitar el DNA afegint 10,5 ml d’isopropanol, barrejar-ho i incubar-ho 5 minuts.
- Durant la incubació treure l’èmbol d’una xeringa i posar-li el QIAprecipitatorModule.
- Posar el QIAprecipitator damunt d’una ampolla de deixalles, transferir la solució d’eluat amb isopropanol i posar-hi l’èmbol.
- Filtrar la barreja amb el QIAprecipitator utilitzant una pressió constant.
- Treure el QIAprecipitator de la xeringa i treure l’èmbol.
- Tornar a posar el QIAprecipitator i afegir 2ml d’etanol 70% a la xeringa.
- Rentar el DNA posant l’èmbol i fent passar l’etanol pel QIAprecipitator.
- Treure el QIAprecipitator de la xeringa i treure l’èmbol. Posar el QIAprecipitator un altre cop i posar l’èmbol. Assecar la membrana fent passar aire a través del QIAprecipitator enèrgicament. Repetir aquest pas diverses vegades.
- Assecar la punta del QIAprecipitator amb paper adsorvent.
- Treure l’èmbol d’una xeringa nova de 5ml i posa-hi el QIAprecipitator.
- Afegir 500 ul de Buffer TE a la xeringa i posa-hi l’èmbol eluint el DNA en un tub fent servir pressió constant.
- Treure el QIAprecipitator de la xeringa, treure l’èmbol i tornar a posar el QIAprecipitator.
- Transferir l’eluit a la xeringa i torna-ho a eluir al mateix tub.
- Mesurar la quantitat de DNA amb l’espectofotòmetre i guardar el tub a la nevera 4ºC.
Resultat:
- [B3GAT1] = 745 ng/ul
