PROTOCOLO habitual de trasfección en CUTURE SLIDES. Retrotransfección durante 24h
Día 1. PolyD
Día 2. tranfección
plantar 120.000 cel/pocillo + 300ul medio
Para 3 cultureslides –> 6 ug MRGPRD (0.815ug/ul) –> 7,4ul + 120 optimen
Para 2 cultureslides –>4ug GPR57 (0.891 ug/ul) –> 4,5ul + 80 optimen
Lipo 16ul + optimen 200ul
–> añadir 10ul/pocillo
Día 3. Inmunos en vivo
- MRGPRD (IgG) –> usamos suero total 1/100 22-2-0846, 22, 23, 26, 56, 59, 86, 87, 91, 100, 6 controles negativos
- GPR157 (IgG) –> usamos IgG purificadas con las que se hicieron los pools, diluidas 1/10 6, 23, 56, 59, 77, 86, 87, 92, 94, 100, controles negativos
- Volumen total 300 ul
Resultados: todo parece negativo pero
MRGPRD hay pocas celulas que marquen el anticuerpo comercial MRGPRD a las 24h y a las 48h. Nada claramente positivo al hacer las células vivas a las 24h. Al hacer las inmunos fijadas con PFA4% tras 48h de transfección veo mucho marcaje en la mayoría de las muestras y de todas las células que no colocaliza con el comercial.
GPR157 se ven muy bien trasfectadas con el anticuerpo anti-DDY, y en en el suero se ve algo de marcaje en la mayoría de las muestras incluídos los controles, tras hacer la muestra en vivo.
