2023.10.18: ICC co-cultivos (día 41 – rata 07/09/2023)

Muestras:

1. GDP1 (CIDP15) suero – ICC vivas
2. MRVM (136-8) suero – ICC vivas
3. MRVM (136-8) IgG –ICC vivas
4. GDP1 (CIDP15) suero – ICC fijadas
5. MRVM (136-8) suero – ICC fijadas
6. MRVM (136-8) IgG –ICC fijadas

Protocolo cels vivas: se hacen lavados con PBS1x entre cada paso

• Incubar con suero 1/100 o IgG 1/10 diluídos en medio NG mielinización: 2h a 37ºC
• Fijar 20min con PFA 4%
• Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
• Bloquear con Goat serum 5%: 30min RT
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT (los pongo juntos)
  •  anti–Caspr1 (ab34151) 1/200
  • anti-MBP (808401) 1/200
• Incubar con anticuerpos secundarios  GAH488 IgG + GAR594 + GAM647 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
• Montar con Fluoromount

Protocolo cels fijadas:

• Fijar 20min con PFA 4%
• Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
• Bloquear con Goat serum 5%: 30min RT
• Incubar con suero 1/100 o IgG 1/10 diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT (los pongo juntos)
  •  anti–Caspr1 (ab34151) 1/200
  • anti-MBP (808401) 1/200
• Incubar con anticuerpos secundarios  GAH488 IgG + GAR594 + GAM647 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
• Montar con Fluoromount

Resultado: en las céls incubadas con los sueros en vivo no hay tanto marcaje general (es más limpio). El marcaje de MBP y de Caspr1 han salido muy bien!!

1. GDP1 (CIDP15) suero – ICC vivas: mielina +++ (hay muchas células “contaminantes” y no salen demasiado bien las fotos). Creo que en realidad el marcaje es de las cels de Schwann mielinizantes y no en la mielina en sí.
2. MRVM (136-8) suero – ICC vivas: no marcan los paranodos, marca débilmente las cels de Schwann mielinizantes (mismo patrón que GDP1 pero muy débil).
3. MRVM (136-8) IgG –ICC vivas: no marcan los paranodos, marca débilmente las cels de Schwann mielinizantes (mismo patrón que GDP1 pero muy débil).
4. GDP1 (CIDP15) suero – ICC fijadas: mielina +++ y axones ++
5. MRVM (136-8) suero – ICC fijadas: marca todo en general… es muy complicado ver los paranodos, aunque creo que un poco sí que se marcan.
6. MRVM (136-8) IgG –ICC fijadas: marca todo en general… es muy complicado ver los paranodos, aunque creo que un poco sí que se marcan.