2023.10.10: ICC co-cultivos (día 33 – rata 07/09/2023)

Cojo cubres de todas las condiciones para ir viendo cómo va la diferenciación:

1. Explante DRG P/L (prueba Caspr1 nuevo)
2. Explante DRG P/L (prueba Caspr1 antiguo)
3. Explante DRG Matrigel
4. Explante médula P/L
5. Explante médula Matrigel
6. Médula disgregada con glía P/L
7. Neuronas médula + Cels Schwann humanas
8. Neuronas médula + Cels Schwann rata
9. Neuronas médula + C2C12

Protocolo:

• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear con Goat serum 5% y 0’3% tritón (en PBS): 1h a RT
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% (MBP y Caspr1 los diluyo en Goat serum 5% y 0,3% tritón):
  • Cubre 1: MBP y Caspr1 nuevo:
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : 2h RT
    • anti-Caspr1, ab34151 (abcam). Dil. 1/100 (rabbit): 2h RT
  • Cubre 2: Caspr1 antiguo y MBP
    • Anti-Caspr1: ab133634 (abcam). Dil 1/10 (rabbit)
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : 2h RT
  • Cubres 3-8: MBP y NFh
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : 3h RT
    • anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken) : 1h RT
  • Cubre 9: Desmina y NFh
    • Anti-desmina: Novocastra.. Dil. 1/50 (mouse) : 2h RT
    • anti-neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken) : 1h RT
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% (todos a 1/500)
  • Cubres 1 y 2: GAM488 (MBP) + GAR594 (Caspr1)
  • Cubres 3-8: GAM488 (MBP) + GAC594 (NFh)
  • Cubre 9: GAM488 (desmina) + GAC594 (NFh)
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado:

1. Explante DRG P/L: hay mucha mielina, pero no se ve el Caspr1
2. Explante DRG P/L (prueba Caspr1): hay mucha mielina, pero no se ve el Caspr1
3. Explante DRG Matrigel: hay mucha mielina
4. Explante médula P/L: todavía no hay mielina
5. Explante médula Matrigel: todavía no hay mielina
6. Médula disgregada con glía P/L: hay mielina pero poca
7. Neuronas médula + Cels Schwann humanas: no hay mielina (tirar!)
8. Neuronas médula + Cels Schwann rata: no hay mielina (tirar!)
9. Neuronas médula + C2C12: no hay casi células C2C12 (tirar!!)