PROTOCOLO habitual de trasfección en cubres. Dejo 24h de trasnfección.
DNA/placa (25 cubres)
8 ug MRGPRD (0.815ug/ul) –> 9.8ul
8ug GPR57 (0.891 ug/ul) –> 9ul
Inmuno en células vivas: suero 1/100 (para IgG e IgM durante 1h), depues fijar con PFA4% 10 min, bloqueo con goat 5% (30 min), primario CMYC 1/100 (mouse), secundarios GAH488 (IgM para MRGPRD, IgG para GPR57), + GAM 594
MUESTRAS A TESTAR
- MRGPRD (IgM): 22-2-0846, 22, 23, 26, 56, 59, 86, 87, 91, 100, control negativo
- GPR57 (IgG): 6, 23, 56, 59, 77, 86, 87, 92, 94, 100, control negativo
RESULTADOS
TODOS LOS SUEROS NEGATIVO. CMYC NEGATIVO POR LO QUE NO PUEDO CONFIRMAR LA TRANSFECCIÓN
Dejo cubres en incubadora hasta 48h, después fijamos PFA4% y repetimos inmuno solo con CMYC que es negativa
Reviso plasmido, tiene un TAG DYK (no CMYC) por lo que repito inmuno para confirmar con secundario anti-DDK (creo que DDK y DYK son sinonimos)
Anticuerpos anti-DYK de origene 1/100 (mouse) + secundario GAM 488 1/1000
RESULTADO: celulas bien transfectadas!!
Repito inmunos con muestras en estas condiciones (células trasfectadas durante 48h, fijadas y permeabilizadas) Suero IgM 1/50; suero IgG 1:100; primario DDK mouse 1/100; secundarios /1000
RESULTADO: Veo cruce de canal entre suero y primario, sobretodo en GPR157
PLAN: repetir sin primario
