2023.09.28: ICC co-cultivos (día 21 – rata 07/09/2023)

Cojo cubres de todas las condiciones para ir viendo cómo va la diferenciación:

1. Explante DRG P/L
2. Explante DRG Matrigel
3. Explante médula P/L
4. Explante médula Matrigel
5. Médula disgregada con glía P/L

Protocolo:

• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear con Goat serum 5% y 0’3% tritón (en PBS): 1h a RT
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% (en PBS):
  • MBP y NFh:
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : 3h RT
    • anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken) : 1h RT
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (todos a 1/500)
  • MBP y NFh: GAM594 + GAC488
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado:

1. Explante DRG P/L: ya hay mielina, aunque es mejor cultivarlos más días para que se vea más
2. Explante DRG Matrigel: ya hay mielina, lo veo igual que en el explante con P/L
3. Explante médula P/L: aún no hay mielina (se marca algo pero no parece mielina, puede que sean células de Schwann que la están produciendo??)
4. Explante médula Matrigel: se ha roto el cubre y no he podido ver nada
5. Médula disgregada con glía P/L: aún no hay mielina (se marca algo pero no parece mielina, puede que sean células de Schwann que la están produciendo??)