Cojo cubres de todas las condiciones para ir viendo cómo va la diferenciación.
Protocolo:
- Fijar 20 min con PFA 4%
- 1 lavado con PBS1x
- Bloquear con Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS): 1h a RT
- Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS):
- MBP y NFh: los pongo los 2 a la vez 2h a RT
- anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse)
- anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken)
- MBP y NFh: los pongo los 2 a la vez 2h a RT
- 3 lavados con PBS1x
- Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (todos a 1/500)
- MBP y NFh: GAM594 + GAM488
- 3 lavados con PBS1x
- Montar con Fluoromount
Resultado: aunque el NFh se ve muy bien,en ninguno de los cubres hay mielina (en el cubre de médula disgregada igual sí que hay un poco, pero es confuso)
