Objetivo: pasar 50 muestras de LCR de pacientes EM en HEKs transfectadas con GlialCAM vivas.
Muestras: LCR de EM
- EM-381
- EM-391
- EM-394
- EM-396
- EM-398
- EM-399
- EM-401
- EM-409
Protocolo cels vivas (sin fijar):
- Incubar con suero 1/100 o LCR 1/10 en medio HEK293 (1h a 37ºC) : preparar 250 ul de cada muestra para cubrir el pozo
- 3 lavados con PBS1x
- Fijar 10 min con PFA4%
- 1 lavado con PBS1x y quitar la pieza de los culture slides
- Permeabilizar 5min con tritón 0,3% (en PBS1x)
- 1 lavado con PBS1x
- Bloquear con Goat serum 5%
- Incubar con anticuerpo comercial anti-CMYC diluído 1/200 en goat serum 5% (1h a RT)
- 3 lavados con PBS1x
- Incubar con Ac.secundarios GAM488 + GAH594 diluídos 1/750 en goat serum 5% (1h a RT)
- 3 lavados PBS1x
- Montar con Fluoromount
Resultado: Se ve bien el C-MYC. Hay un poco de cruce de canal con el LCR. A Gemma le parece positivo el LCR EM-401, pero a mi no. REPETIR SIN HACER DOBLE CON C-MYC PARA EVITAR CRUCE DE CANAL.
