2023.08.17: Starter NF186
- Glicerolat NF186: sense deixar que el glicerolat es descongeli (recollir del congelador en gel), raspar la mostra de glicerolat amb el bacteri transfectat d’interès (amb una punta)
- Posar la punta a un tub falcon de bacteris amb 5 mL de LB + ampicilina 1/1000
- Deixar unes hores a 37ºC agitant a 225-250 rpm (agitador orbital)
- Preparar un erlenmeyer de 250 mL de medi LB amb ampicil·lina 1/1000
- A última hora de la tarda abocar l’starter prèviament seleccionat a l’erlenmeyer.
- Incubar overnight a 37 ºC en agitació (agitador orbital)
2023.08.18: Maxiprep NF186
Hago 2 maxis de NF186. Seguir el protocol del kit HiSpeed Plasmid Maxi Kit:
- Centrifugar el cultiu a 6000G durant 15 minuts a 4ºC (ultracentrífuga 3a planta).
- Resuspendre el pellet en 10 ml de Buffer P1 (aquest és l’únic pas que cal fer a la cabina de bacteris)
- Afegir 10ml de Buffer P2, barrejar-ho per inversió i incubar-ho fins que la solució es torni blava (aproximadament 5 minuts).
- Durant la incubació, posar el tap del QIAfilterCartridge.
- Afegir 10ml de Buffer P3 al lisat i barrejar-ho immediatament fins que la solució sigui completament incolora.
- Abocar el lisat al QIA filterCartridge i incuba-ho a temperatura ambient durant 10 minuts.
- Equilibrar un HiSpeed Tip amb 10 ml de Buffer QBT.
- Treure el tap del QIAfilterCartidge i gradualment insertar l’èmbol i filtrar el lisat cel·lular al HiSpeed Tip equilibrat.
- Un cop el lisat ha entrat, rentar el HiSpeed Tip amb 60ml de Buffer QC.
- Eluir el DNA amb 15ml de Buffer QF en tubs de 50 ml.
- Precipitar el DNA afegint 10,5 ml d’isopropanol, barrejar-ho i incubar-ho 5 minuts.
- Durant la incubació treure l’èmbol d’una xeringa i posar-li el QIAprecipitatorModule.
- Posar el QIAprecipitator damunt d’una ampolla de deixalles, transferir la solució d’eluat amb isopropanol i posar-hi l’èmbol.
- Filtrar la barreja amb el QIAprecipitator utilitzant una pressió constant.
- Treure el QIAprecipitator de la xeringa i treure l’èmbol.
- Tornar a posar el QIAprecipitator i afegir 2ml d’etanol 70% a la xeringa.
- Rentar el DNA posant l’èmbol i fent passar l’etanol pel QIAprecipitator.
- Treure el QIAprecipitator de la xeringa i treure l’èmbol. Posar el QIAprecipitator un altre cop i posar l’èmbol. Assecar la membrana fent passar aire a través del QIAprecipitator enèrgicament. Repetir aquest pas diverses vegades.
- Assecar la punta del QIAprecipitator amb paper adsorvent.
- Treure l’èmbol d’una xeringa nova de 5ml i posa-hi el QIAprecipitator.
- Afegir 500 ul de Buffer TE a la xeringa i posa-hi l’èmbol eluint el DNA en un tub fent servir pressió constant.
- Treure el QIAprecipitator de la xeringa, treure l’èmbol i tornar a posar el QIAprecipitator.
- Transferir l’eluit a la xeringa i torna-ho a eluir al mateix tub.
- Mesurar la quantitat de DNA amb l’espectofotòmetre i guardar el tub a la nevera 4ºC.
Resultat:
- [NF186] = 1,14 ug/ul
- [NF186] = 0,93 ug/ul
