2023.08.08: ICC médula disgregada (con glía) (día 19 – rata 20/07/2023)

Cojo 2 cubres de médula disgregada con glía, para ver si están diferenciando

Protocolo cubre 1:

• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear con Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS): 1h a RT
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón  (en PBS):
  • MBP y NFh
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : (overnight 4ºC)
    • anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken) : 1h RT
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (todos a 1/500)
  • MBP y NFh: GAM488 + GAC594
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Protocolo cubre 2:

• Incubar con suero CNTN1+ 1/100 (IgG) en medio NG: 2h  37ºC
• 1 lavado con PBS
• Fijar 10 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Incubar con anticuerpo primario diluído en Goat serum 5% (1h RT) : NFh 1/500
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% tritón 0’5% (todos a 1/500:
  • Doble suero – NFh: GAH488 IgG + GAC594
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con fluoromount

Resultado:

• Cubre 1: el NFh sólo se ve a trozos. No hay mielina
• Cubre 2: el suero CNTN1+ es muy +++. El NFh se ve muy bien (quizás pasó algo con la immuno del cubre 1 y por eso no se ve tan bien).