2023.08.08: ICC co-cultivos (día 19 – rata 20/07/2023)

Cojo 1 cubre de explante DRG coating habitual, 1 cubre de explante DRG matrigel y 1 cubre de DRG disgregadas matrigel para ver cómo va la diferenciación

*También cojo 1 cubre de los co-cultivos del 01/06/2023, para acabar de determinar si los uso o no.

Protocolo:

• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear con Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS): 1h a RT
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón  (en PBS):
  • MBP y NFh
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : (overnight 4ºC)
    • anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken) : 1h RT
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (todos a 1/500)
  • MBP y NFh: GAM488 + GAC594
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado:

• Explante DRG coating habitual (Poly-D/laminina): el NFh se ve flojo pero bien. La mielina no se ve pero parece que se esté empezando a formar (los núcleos de las cels de Schwann están alineados)
• Explante DRG matrigel: el NFh se ve muy bien. Hay un poco de mielina (muy poquita)
• DRG cels disgregadas matrigel: el NFh se ve muy bien. No hay mielina.
• Explante DRG 01/06/23: el NFh se ve muy bien. No hay mielina