2023.01.10-2023.01.12: Tranfección HEK293- NCAM2 / LGI4

Objetivo: transfección de 5 cultures slides de NCAM2 y uno de LGI4 (4 pozos LGI4 + ADAM22; 2 pozos LGI4 + ADAM23; 2 pozos LGI4)

Transfección células HEK293- LGI4 / NCAM2 – Dia 1

Poner 0.3ml de poly-D-lysina 1/40 diluida en PBS 1x estéril en cada pozo del portaobjetos del cultivo cel·lular. Incubar toda la noche a 37ºC.

Transfección células HEK293- LGI4 / NCAM2- Dia 2

Retirar la solucion de poly-D-lysina de los pozos, sembrar 0.3 mL de medio + 120.000 celulas HEK en cada pozo.

1. Preparar las soluciones de transfección de DNA y lipofectamina por separado
   • 1.6 ug DNA + 40 ul optimem por cada 8 pozos
     1. NCAM 2 (5 culture slides)- 40 pozos
        • [NCAM2] = 890.4 ng/ul — 8 ug DNA + 200ul optimem — 9 ul DNA + 200 ul optimem
     2. LGI 4 / ADAM22 (4 pozos) — 0.8 ug DNA (4.4+4.4) + 20 ul optimum — 2.3ul LGI4 + 2.3 ul ADAM22 + 20 ul optimem
        • [LGI4]=168 ng/ul — 2.3 ul
        • [ADAM22]= 175 ng/ul  –2.3 ul
     3. LGI4 / ADAM23 (2 pozos) à 0.4ug DNA (2.2+2.2) + 10ul optimem — 1.15 ul LGI4 + 0.8 ul ADAM23 + 10ul optimem
        • [LGI4]=168 ng/ul — 1.15ul
        • [ADAM23]= 250 ng/ul — 0.8ul
     4. LGI4 aislado (2 pozos) — 0.4 ul DNA + 10 ul optimem à 2.3 ul LGI4 + 10ul optimem
        • [LGI4]=168 ng/ul à 2.3 ul
   • 3.2 ul lipofectamina + 40ul optimem por cada 8 pozos)
     • NCAM2 (5 culture slides)  — 16 ul lipofectamina +200 ul optimem
     • LGI 4/ ADAM22 (4 pozos) — 1.6 ul lipofectamina  + 20 ul optimem
     • LGI4/ ADAM23 (2 pozos) — 0.8 ul lipofectamina + 10 ul optimem
     • LGI4 aislado (2 pozos) — 0.8 ul lipofectamina + 10 ul optimem
2. Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente, mezclar las dos soluciones (1:1) e incubar durante 20 minutos.

Transfección células HEK293- LGI4 / NCAM2- Dia 3

Fijar 10 minutos con PFA 4%

PBS 1x en los pozos y congelar

Resultados:

ADAM22 no se ha trasnfectado y LGI4 sí pero solo se ve si se permeabiliza –> 2023.01.17- ICC HEK-LGI4/ADAM22

NCAM2 se trasnfecta pero pocas células, cuando lo dejamos más horas se transfectaban muchas–> mejor trasnfectar una tarde y sacar a los dos días por la mañana .