Samples: HEK293 cells transfected with NF155 (20180416- 20180418: Transfection of NF155 in HEK293 cells + freeze (for WB Native PAGE)
Extraction:
- Extraction with 100 ul of Pierce IP lysis Buffer + protease inhibitors 1x + phosphatase inhibitors 1x
- Incubate 15 min on ice
- Centrifuge 15 mins at 4ºC (vmax)
Quantification (with Pierce BCA Protein Assay Kit):
- Preparació de la corba de BSA.
| Vial | Volum de Pierce IP Lysis Buffer (µL) | Volum de BSA | Concentració final de BSA (µg/ml) |
| A | 0 | 30 µL del Stock | 2000 |
| B | 12’5 | 37’5µL del Stock | 1500 |
| C | 32’5 | 32’5µL del Stock | 1000 |
| D | 17’5 | 17’5µL del vial B | 750 |
| E | 32’5 | 32’5µL del vial C | 500 |
| F | 32’5 | 32’5µL del vial E | 250 |
| G | 32’5 | 32’5µL del vial F | 125 |
| H | 40 | 10µL del vial G | 25 |
| I | 40 | 0 | 0 = Blanc |
- Preparació delBCA Working Reagent –>50 parts del reactiu A + 1 part del reactiu B (tenir en compte que caldrà posar 200 µl d’aquesta barreja a cada pou).
- Preparar un esquema de la placa que es farà –> tant la corba com les mostres s’han de fer per duplicat.
- Diluir les mostres 1/10 en Lysis buffer + inhibidors
- Afegir 10 µl de cada mostra al seu pou corresponent
- Afegir 200 µl de BCA Working Reagent a cada pou
- Tapar la placa amb paper de plata i incubar 30 minuts a 37ºC
- Llegir la placa a 570 nm
RESULTS:
- HEK293 NF155 extract (1): 9.3 microg/microl
- HEK293 NF155 extract (2): 12.1 microg/microl
- HEK293 extract (non-transfected cells): 10.9 microg/microl
The extracts are stored at -20ºC
