24.03.21: ICQ Perfil nodales/paranodales BD. ELISA CASPR1 + NF155 SUBCLASES Y TITULACIÓN + NF140 + NF186

ICQ Perfil nodales/paranodales BD

6 culture slides transfectados el dia 18/03/24

Muestras:

• Control positivo
• 24-2-392 à BOX 370
• 24-2-395 à BOX 370
• 24-2-396 à BOX 370
• 24-2-397 à BOX 370
• 24-2-398 à BOX 370
• 24-2-399 à BOX 370
• 24-2-400 à BOX 370
• 24-2-401 à BOX 370
• 24-2-402 à BOX 370

Protocolo:

• Incubar 1hora a T. ambiente los sueros diluidos a 1:100 con solución de bloqueo.
• Lavar 3 veces con PBS 1X.
• Incubar 1 hora con 30-40uL del Ac primario diluido a 1:500 con solución de bloqueo.
• Lavar 3 veces con PBS 1X
• Incubar 1 hora con 30-40uL del Ac secundario diluido a 1:500 con solución de bloqueo.
  • CNTN1: RAG488 + RAH594 a Rabbit Serum 1/40
  • NF155, NF140, NF186: GAC488 + GAH594 a Goat Serum 5%.
  • CASPR1: GAR 488 + GAH594
• Lavar 3 veces con PBS 1X
• Poner medio de montaje “fluoromount” i cobrir con un cubreobjetos.
• Analizar resultados al microscopio de fluorescencia.

Resultado:

		Resultado
Muestra	BOX	CNTN1	NF140	NF155	NF186
Control Positivo	Controls	+++	+++	+++	+++
24-2-392	BOX 370	–	–	–	–
24-2-395	BOX 370	–	–	–	–
24-2-396	BOX 370	–	–	–	–
24-2-397	BOX 370	–	–	–	–
24-2-398	BOX 370	–	–	–	–
24-2-399	BOX 370	–	–	–	–
24-2-400	BOX 370	–	–	–	–
24-2-401	BOX 370	–	–	–	–
24-2-402	BOX 370	–	–	–	–

ELISA CASPR1 + NF155 SUBCLASES Y TITULACIÓN + NF140 + NF186

Muestras CASPR1

• 24-2-0478 à BOX 374
• 24-2-0479 à BOX 374
• 24-2-0480 à BOX 374
• 24-2-0481 à BOX 374
• 24-2-0482 à BOX 374

Muestra NF155 (titulación y subclases):   24-2-384 àBOX 370

Muestra NF (155, 140 y 186): 24-2-0297 à BOX 367

Plantilla placa:

• Columna 1-2 à CASPR1

• Columna 3-4-5-6 à Nf155

• Columna 7 à NF140

• Columna 8 à NF 186

1	1	2	3	4	5	6	7	8
A prot	Cneg	24-2-0480	Cneg NF155	24-2-0384 1/900	24-2-0384 G1	24-2-0297	Cneg	Cneg
B blanc	Cneg	24-2-0480	Cneg NF155	24-2-0384 1/900	24-2-0384 G1	24-2-0297	Cneg	Cneg
C prot	Cpos CASPR1	24-2-0481	Cpos Nf155	24-2-0384 1/2700	24-2-0384 G2		Cpos Nf140	Cpos Nf186
D blanc	Cpos CASPR1	24-2-0481	Cpos Nf155	24-2-0384 1/2700	24-2-0384 G2		Cpos Nf140	Cpos Nf186
E prot	24-2-0478	24-2-0482	24-2-0384 1/100	24-2-0384 1/8100	24-2-0384 G3		24-2-0297	24-2-0297
F blanc	24-2-0478	24-2-0482	24-2-0384 1/100	24-2-0384 1/8100	24-2-0384 G3		24-2-0297	24-2-0297
G prot	24-2-0479		24-2-0384 1/300	24-2-0384 1/24300	24-2-0384 G4
Hblanc	24-2-0479		24-2-0384 1/300	24-2-0384 1/24300	24-2-0384 G4

Protocolo:

• Bloquear con leche 5% en PBS-tween 0’1% : 200 ul pozo (incubar 1h a temp. ambiente)
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Diluir los  sueros:
  • Subclases:  diluir sueros 1/100 en leche 5% en PBS-tween 0’1%
  • Titulación: diluir sueros a 1/100, 1/300, 1/900, 1/2700, 1/8100 y 1/24300 en leche 5% en PBS-tween 0’1%
• Incubar con los sueros 1h a RT
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Ac secundarios:
  • Screening / confirmación: Incubar con RAH IgG HRP 1/3000 en leche 5% en PBS-tween 0’1% : 100 ul/pozo, 45 min
  • Subclases: Incubar con IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 1/500 en leche 5% en PBS-tween 0’1% : 100 ul/pozo, 45 min
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Incubar 5min con TMB: preparar solución un rato antes y tapar de la luz (para que se atempere) : 100 ul/pozo
• Parar la reacción con 50ul de H₂SO₄ 25%
• Leer a 450-570 nm

Resultado:

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	0,06	0,075	0,076	0,084	0,091	0,013	0,078	0,119
B	0,081	0,105	0,08	0,05	0,061	0,036	0,123	0,119
C	1,269	0,068	0,863	0,077	0,133	0,021	0,839	0,13
D	0,101	0,08	0,22	0,047	0,1	0	0,039	0,027
E	0,11	0,08	0,423	0,06	0,061	0	0,125	0,024
F	0,115	0,083	0,062	0,059	0,051	0	0,115	0,035
G	0,112	0	0,126	0,064	0,141	0	0	0
H	0,115	0	0,075	0,072	0,066	0	0	0