Objetivo: incubar las células con IgG separadas de sueros/plasmas positivos durante 10 días e ir añadiendo cada 2 días medio nuevo (con nuevas IgGs)
Muestras: por duplicado
- IgG Cneg 21-2-1040
- IgG Cneg 21-2-1041
- IgG CASPR1+ Bocanegra (22-2-374)
- IgG CASPR1+ A.Blanco (23-2-656)
- IgG NF155+ Morón (plasmaféresis)
- IgG NF155+ De Haro (plasmaféresis)
- IgG NF186+ Berni Sagaste (22-2-1027)
- IgG panNF+ Reference (22-2-1028)
- IgG CNTN1+ A.Vidal Pla (plasmaféresis)
- IgG CNTN1+ A.Leggeri (21-2-94)
Protocolo ICC (día 02/02/2024): entre cada paso hacer lavados con PBS1x
- Incubar con IgGs diluídas 1/20 en medio NG mielinización a 37ºC (preparo 50ul IgG en 950 ul de medio)
- Para añadir IgG cada 48h: preparo 25 ul de IgG en 475ul de medio, quito 250ul de medio de las células y pongo los nuevos 250ul (el experimento se hace por duplicado)
- Fijar con PFA4% 20min
- Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
- Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT (los pongo juntos)
- anti–Caspr1 (ab34151) 1/200
- anti-MBP (808401) 1/200
- anti-panNF 1/200
- Incubar con anticuerpos secundarios: GAR594 + GAM488 + GAC647 diluídos 1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
- Montar con Fluoromount
Resultado (día 02/02/2024): la ICC de panNF no se ve bien!!! (no se ve nada con el GAC647). Creo que ya hay demasiadas células y están demasiado crecidos los cultivos… Las mejores ICC de una semana salieron el día 12/12/2023.
