2024.01.24: ICC co-cultivos DRG (días 88,89 – rata 27/10/2023, y días 12,13 – rata 11/01/2024)

Objetivo:

• Co-cultivos 27/10: incubar las células con dos sueros que marcan mielina para ver cómo se ven
• Co-cultivos 11/01: incubar las células con un suero y un LCR para hacer screening en neuronas DRG

Muestras:   1-3 co-cultivos 27/10, 4-6 co-cultivos 11/01

1. 23-2-427 (marcaje mielina nervio de mono)
2. CIDP15 (LIF+)
3. Cneg 23-2-1040
4. 23-2-1327
5. 23-5-1328
6. Cneg 23-2-1040

Protocolo ICC cels vivas: entre cada paso hacer lavados con PBS1x

• Incubar con suero diluído 1/100 (o LCR 1/10) en medio NG mielinización, 2h a 37ºC (preparo 4ul de suero en 400 ul de medio, o 40ul de LCR en 360ul de medio)
• Fijar con PFA4% 20min
• Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: overnight a 4ºC
  • Cubres 1-3:
    • anti–Caspr1 (ab34151) 1/200
    • anti-MBP (808401) 1/200
  • Cubres 4-6:
    • Anti-NF200 (rabbit) 1/200
• Incubar con anticuerpos secundarios: diluídos 1/500 en Goat serum 5%: 1h RT.
  • Cubres 1-3:  GAH488 IgG + GAR594 + GAM647
  • Cubres 4-6: GAH488 IgG + GAR594
• Montar con Fluoromount

Resultado (día 24/01/2024): 

1. 23-2-427 (marcaje mielina nervio de mono): marcaje de mielina
2. CIDP15 (LIF+): marcaje de mielina
3. Cneg 23-2-1040: negativo
4. 23-2-1327: negativo
5. 23-5-1328: negativo
6. Cneg 23-2-1040: negativo