2023.12.20-27: ICC co-cultivos DRG (días 54 a 61 –  rata 27/10/2023, incubación sueros 1 semana)

Objetivo: incubar las células con los sueros durante 1 semana e ir añadiendo cada día suero nuevo (repetición similar a experimento D del día 11/12/23)

Muestras:

1. Cneg 217-32
2. Cneg 217-33
3. NF155+ 212-14 (Morón)
4. NF155+ 216-17 (De Haro)
5. CASPR1+ 136-8 (Vinuesa)
6. CASPR1+ 23-2-656 (Blanco)
7. CASPR1+ 22-2-374 (Bocanegra)
8. panNF+ 23-2-82 Box 318
9. panNF+ 23-2-1183

Protocolo ICC cels vivas (día 27/12/23): entre cada paso hacer lavados con PBS1x

• Incubar con sueros diluídos 1/100 en medio NG mielinización a 37ºC (preparo 5 en 500 ul)
  • Para añadir suero cada 24h: preparo 3ul de suero en 300ul de medio NG, quito 250ul de medio NG de las células y pongo los nuevos 300ul.
• Fijar con PFA4% 20min
• Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT (los pongo juntos)
  • anti–Caspr1 (ab34151)  1/300
  • anti-MBP (808401) 1/300
• Incubar con anticuerpos secundarios:
  • Muestras 1, 3, 5, 7, 8: GAH Kappa biot + GAR594 + GAM647 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT.
  • Muestras 2, 4, 6, 9: GAH Lambda biot + GAR594 + GAM647 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT.
• Incubar con Streptavidina 488 diluída 1/1000 en Goat serum 5% 1h RT
• Montar con Fluoromount

Resultado (ICC día 27/12/2023): augmentar la concentración de anticuerpo MBP, ya que se ve flojo. En esta ocasión no veo tanta diferencia entre lo que ocurre en los Cneg y en los pacientes, hay que hacer contage de los paranodos intactos vs rotos para ver diferencias. No hago fotos para no perder el tiempo.

1. Cneg 217-32: casi todos los paranodos intactos. Verde negativo (K)
2. Cneg 217-33: casi todos los paranodos intactos. Verde negativo (L)
3. NF155+ 212-14 (Morón): muchos paranodos rotos. Verde marcaje mielina (K)
4. NF155+ 216-17 (De Haro): muchos paranodos rotos. Verde muy poco marcaje (L)
5. CASPR1+ 136-8 (Vinuesa): muchos paranodos rotos. Verde poco marcaje (K)
6. CASPR1+ 23-2-656 (Blanco): muchos paranodos rotos. En verde se ven precipitados (o se pega el suero a ciertos sitios de los co-cultivos) (L)
7. CASPR1+ 22-2-374 (Bocanegra): muchos paranodos rotos y nodos alargados. Verde no hay marcaje (K)
8. panNF+ 23-2-82 Box 318: muchos paranodos rotos y nodos alargados. Verde no hay marcaje (K)
9. panNF+ 23-2-1183: muchos paranodos rotos y nodos alargados. Verde marca algunos nodos (L)