Objetivo: incubar las células con los sueros 72h e ir añadiendo cada día suero nuevo (repetición de experimento C del día 11/12/23)
Muestras:
- Cneg 217-32
- Cneg 217-33
- NF155+ 212-14 (Morón)
- NF155+ 216-17 (De Haro)
- CASPR1+ 136-8 (Vinuesa)
- CASPR1+ 23-2-656 (Blanco)
- CASPR1+ 22-2-374 (Bocanegra)
- CNTN1+ 21-2-94
- CNTN1+ 22-2-854
- panNF+ 23-2-82 Box 318
- panNF+ 23-2-1183
Protocolo ICC cels vivas (día 22/12/23): entre cada paso hacer lavados con PBS1x
- Incubar con sueros diluídos 1/100 en medio NG mielinización a 37ºC (preparo 5 en 500 ul)
- Para añadir suero cada 24h: preparo 3ul de suero en 300ul de medio NG, quito 300ul de medio NG de las células y pongo los nuevos 300ul.
- Fijar con PFA4% 20min
- Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
- Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: overnight a 4ºC (los pongo juntos)
- anti–Caspr1 (ab34151) 1/300
- anti-MBP (808401) 1/300
- Incubar con anticuerpos secundarios GAH488 IgG + GAR594 + GAM647 diluídos 1/500 en Goat serum 5%: 1h RT.
- Montar con Fluoromount
Resultado (ICC 22-23/12/2023): los controles marcan mucho la mielina. La ICC de CASPR1 no ha salido demasiado bien. En general los paranodos están mucho más intactos que en la incubación de sueros durante 1 semana (en todas las condiciones los paranodos están prácticamente intactos).
- Cneg 217-32
- Cneg 217-33
- NF155+ 212-14 (Morón): marcaje de paranodos
- NF155+ 216-17 (De Haro): marcaje de paranodos
- CASPR1+ 136-8 (Vinuesa): hay un ligero marcaje en algunos paranodos
- CASPR1+ 23-2-656 (Blanco): hay un ligero marcaje en algunos paranodos. Hay muchas capas de células y mucho marcaje en general, difícil de analizar.
- CASPR1+ 22-2-374 (Bocanegra): no veo ningún marcaje de paranodo. Hay marcaje de mielina
- CNTN1+ 21-2-94: no hay marcaje de paranodos, marcaje mielina
- CNTN1+ 22-2-854: marca algunos paranodos
- panNF+ 23-2-82 Box 318: marcaje de nodos. Paranodos casi intactos
- panNF+ 23-2-1183: marcaje de nodos. Paranodos casi intactos
| 4. 216-17 NF155+ suero |
