2023.12.11-18: ICC co-cultivos DRG y médula (días 45 a 52 – rata 27/10/2023 – incubación sueros 1 semana)

Objetivo: Mismas muestras en 4 tipos de experimentos diferentes (se ponen en posts diferentes para que quede más claro)

1. Co-cultivos médula: incubación sueros 24h
2. Co-cultivos DRG: incubación sueros 24h
3. Co-cultivos DRG: incubación sueros 72h (cada día voy añadiendo suero nuevo)
4. Co-cultivos DRG: incubación sueros  1 semana (sólo lo hago con las muestras 1 a 6, cada día voy añadiendo suero nuevo menos sábado y domingo)

Muestras:

1. Cneg 200-2
2. Cneg 204-11
3. NF155+ 212-14 (Morón)
4. NF155+ 216-17 (De Haro)
5. CASPR1+ 136-8 (Vinuesa)
6. CASPR1+ 23-2-656 (Blanco)

Protocolo cels vivas: entre cada paso hacer lavados con PBS1x

• Incubar con sueros diluídos 1/100 en medio NG a 37ºC (preparo 4 en 400 ul)
  • Para añadir suero cada 24h: preparo 4ul de suero en 200ul de medio NG, quito 200ul de medio NG de las células y pongo los nuevos 200ul. El fin de semana (sábado 16 y domingo 17) no añado sueros porque no puedo venir
• Fijar con PFA4% 20min
• Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT (los pongo juntos)
  • Muestras impares:
    • anti–Caspr1 (ab34151)  1/300
    • anti-MBP (808401) 1/300
  • Muestras pares:
    • anti–panNF (AF3235)1/300
    • anti-MBP (808401) 1/300
• Incubar con anticuerpos secundarios: diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Muestras impares:  GAH488 IgG + GAR594 + GAM647
  • Muestras pares: GAH488 IgG + GAC594 + GAM647
• Montar con Fluoromount

Resultado ICC (d) día 18/12/2023:

1. Cneg 200-2: no hay marcaje. Los paranodos están intactos
2. Cneg 204-11: no hay marcaje. Los paranodos están intactos
3. NF155+ 212-14 (Morón): la mayoría de los paranodos están rotos, se ve un ligero marcaje alrededor de los paranodos y de la mielina.
4. NF155+ 216-17 (De Haro): la mayoría de los paranodos están rotos, se ve un ligero marcaje alrededor de los paranodos y de la mielina.
5. CASPR1+ 136-8 (Vinuesa): la mayoría de los paranodos están rotos (no hay caspr1, o se ve sólo una mitad del paranodo), aunque no se ve el propio marcaje del suero.
6. CASPR1+ 23-2-656 (Blanco): no puedo determinar si los paranodos están rotos o no porque he puesto panNF, que marca principalmente los nodos.