2023.12.11-14: ICC co-cultivos DRG y médula (días 45 a 48 – rata 27/10/2023 – incubación sueros 72h)

Objetivo: Mismas muestras en 4 tipos de experimentos diferentes (se ponen en posts diferentes para que quede más claro)

1. Co-cultivos médula: incubación sueros 24h
2. Co-cultivos DRG: incubación sueros 24h
3. Co-cultivos DRG: incubación sueros 72h (cada día voy añadiendo suero nuevo)
4. Co-cultivos DRG: incubación sueros  1 semana (sólo lo hago con las muestras 1 a 6, cada día voy añadiendo suero nuevo)

Muestras:

1. Cneg 200-2
2. Cneg 204-11
3. NF155+ 212-14 (Morón)
4. NF155+ 216-17 (De Haro)
5. CASPR1+ 136-8 (Vinuesa)
6. CASPR1+ 23-2-656 (Blanco)
7. CNTN1+ 21-2-94
8. CNTN1+ 22-2-854
9. panNF+ 23-2-82 Box 318
10. panNF+ 23-2-1183
11. NF186+ 22-2-1027 Box 312

Protocolo cels vivas: entre cada paso hacer lavados con PBS1x

• Incubar con sueros diluídos 1/100 en medio NG a 37ºC (preparo 4 en 400 ul)
  • Para añadir suero cada 24h: preparo 4ul de suero en 200ul de medio NG, quito 200ul de medio NG de las células y pongo los nuevos 200ul.
• Fijar con PFA4% 20min
• Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT (los pongo juntos)
  • Muestras impares:
    • anti–Caspr1 (ab34151)  1/300
    • anti-MBP (808401) 1/300
  • Muestras pares:
    • anti–panNF (AF3235)1/300
    • anti-MBP (808401) 1/300
• Incubar con anticuerpos secundarios: diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Muestras impares:  GAH488 IgG + GAR594 + GAM647
  • Muestras pares: GAH488 IgG + GAC594 + GAM647
• Montar con Fluoromount

Resultado ICC (c) día 14/12/2023:  no se porqué la ICC ha salido en general muy baja… no puedo ver el marcaje de MBP y por tanto no puedo comprobar correctamente los resultados.