2023.12.11: ICC co-cultivos DRG y médula (día 45 – rata 27/10/2023 – incubación sueros 24h)

Objetivo: Mismas muestras en 4 tipos de experimentos diferentes (se ponen en posts diferentes para que quede más claro)

Co-cultivos médula: incubación sueros 24h
Co-cultivos DRG: incubación sueros 24h
Co-cultivos DRG: incubación sueros 72h (cada día voy añadiendo suero nuevo)
Co-cultivos DRG: incubación sueros 1 semana (sólo lo hago con las muestras 1 a 6, cada día voy añadiendo suero nuevo)

Muestras:

Protocolo cels vivas: entre cada paso hacer lavados con PBS1x

Incubar con sueros diluídos 1/100 en medio NG a 37ºC (preparo 4 en 400 ul)
- Para añadir suero cada 24h: preparo 4ul de suero en 200ul de medio NG, quito 200ul de medio NG de las células y pongo los nuevos 200ul.
Fijar con PFA4% 20min
Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT (los pongo juntos)
- Muestras impares:
  - anti–Caspr1 (ab34151) 1/300
  - anti-MBP (808401) 1/300
- Muestras pares:
  - anti–panNF (AF3235)1/300
  - anti-MBP (808401) 1/300
Incubar con anticuerpos secundarios: diluídos 1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
- Muestras impares: GAH488 IgG + GAR594 + GAM647
- Muestras pares: GAH488 IgG + GAC594 + GAM647
Montar con Fluoromount

Resultado ICC (a) día 12/12/2023: todavía no hay mielina en los co-cultivos de médula, y por lo tanto no se pueden valorar los resultados.

Resultado ICC (b) día 12/12/2023:

Cneg 200-2: neg
Cneg 204-11: neg
NF155+ 212-14 (Morón): marca el nodo y alrededor del PN, también un poco alrededor de la mielina.
NF155+ 216-17 (De Haro): marca el nodo y alrededor del PN, también un poco alrededor de la mielina.
CASPR1+ 136-8 (Vinuesa): no marca los paranodos
CASPR1+ 23-2-656 (Blanco): no marca nada
CNTN1+ 21-2-94: no marca los paranodos
CNTN1+ 22-2-854: marca un poco algún paranodo
panNF+ 23-2-82 Box 318: marca nodos
panNF+ 23-2-1183: marca nodos
NF186+ 22-2-1027 Box 312: marca los nodos pero no todos

Published by Cinta Lleixa