Muestras:
- 23-2-1111: titulación CASPR1 y subclases
- 23-2-554: titulación CASPR1 y subclases
- 23-2-1110: screening CASPR1
Protocolo:
- Bloquear con leche 5% en PBS-tween 0’1% : 200 ul pozo (incubar 1h a temp. ambiente)
- Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
- Diluir los sueros:
- Titulación: preparar un tubo con 400 ul de suero diluído 1/100 en leche 5%, y poner en 5 tubos 280 ul de leche 5%. Pasar 140 ul de dilución del primer tubo al 2º tubo, y así sucesivamente hasta obtener las 6 diluciones (a: 1/100, b:1/300, c:1/900, d: 1/2700, e: 1/8100 i f: 1/24300)
- Subclases* y screening: diluir sueros 1/100 en leche 5% en PBS-tween 0’1%
*En este caso hago las subclases a 1/50
- Incubar con los sueros 1h a RT
- Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
- Ac secundarios:
- Titulación / screening / confirmación: Incubar con RAH IgG HRP 1/3000 en leche 5% en PBS-tween 0’1% : 100 ul/pozo, 45 min
- Subclases: Incubar con MAH HRP* IgG1 o IgG2 o IgG3 o IgG4 1/1000 en leche 5% en PBS-tween 0’1%: 100 ul/pozo, 45 min
*En este caso pongo los Ac.secundarios de subclases a 1/500
- Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
- Incubar 5min con TMB: preparar solución un rato antes y tapar de la luz (para que se atempere) : 100 ul/pozo
- Parar la reacción con 50ul de H2SO4 25%
- Leer a 450-570 nm
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| A prot | Cneg | 23-2-554 1/900 | 23-2-1111 1/100 | 23-2-1111 1/8100 | 23-2-554 IgG1 | 23-2-1111 IgG1 | ||||||
| B blanc | Cneg | 23-2-554 1/900 | 23-2-1111 1/100 | 23-2-1111 1/8100 | 23-2-554 IgG1 | 23-2-1111 IgG1 | ||||||
| C prot | Cpos CASPR1 | 23-2-554 1/2700 | 23-2-1111 1/300 | 23-2-1111 1/24300 | 23-2-554 IgG2 | 23-2-1111 IgG2 | ||||||
| D blanc | Cpos CASPR1 | 23-2-554 1/2700 | 23-2-1111 1/300 | 23-2-1111 1/24300 | 23-2-554 IgG2 | 23-2-1111 IgG2 | ||||||
| E prot | 23-2-554 1/100 | 23-2-554 1/8100 | 23-2-1111 1/900 | 23-2-1110 1/100 | 23-2-554 IgG3 | 23-2-1111 IgG3 | ||||||
| F blanc | 23-2-554 1/100 | 23-2-554 1/8100 | 23-2-1111 1/900 | 23-2-1110 1/100 | 23-2-554 IgG3 | 23-2-1111 IgG3 | ||||||
| G prot | 23-2-554 1/300 | 23-2-554 1/24300 | 23-2-1111 1/2700 | 23-2-554 IgG4 | 23-2-1111 IgG4 | |||||||
| Hblanc | 23-2-554 1/300 | 23-2-554 1/24300 | 23-2-1111 1/2700 | 23-2-554 IgG4 | 23-2-1111 IgG4 |
Resultado:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A prot | 0,041 | 0,104 | 0,756 | 0,054 | 0,123 | 0,165 | ||||||
| B blanc | 0,085 | 0,038 | 0,105 | 0,04 | 0,044 | 0,063 | ||||||
| C prot | 1,432 | 0,055 | 0,284 | 0,049 | 0,157 | 0,191 | ||||||
| D blanc | 0,029 | 0,046 | 0,055 | 0,035 | 0,113 | 0,126 | ||||||
| E prot | 0,535 | 0,049 | 0,168 | 0,391 | 0,053 | 0,075 | ||||||
| F blanc | 0,104 | 0,04 | 0,051 | 0,075 | 0,047 | 0,049 | ||||||
| G prot | 0,119 | 0,047 | 0,062 | 0 | 0,042 | 0,082 | ||||||
| Hblanc | 0,068 | 0,039 | 0,047 | 0 | 0,029 | 0,041 |
Resultado:
- 23-2-1111: título CASPR1 1/900. Subclase IgG1 (muy débil!!). Misma muestra que 23-2-554 pero enviada tiempo más tarde.
- 23-2-554: título CASPR1 1/900. Subclase IgG1 (muy débil!!).
- 23-2-1110: CASPR1 positivo: titular y subclases
