2023.10.16: ICC co-cultivos (día 39 – rata 07/09/2023)

Cojo cubres de explantes DRG P/L para tratar de ver marcaje con el ac.comercial anti-Caspr1 nuevo (ab34151, abcam):

1. Caspr1 (cels vivas, sin permeabilizar)
2. Caspr1 (cels fijadas, permeab. tritón 0,3%)
3. Doble Caspr1 – MBP (cels fijadas, permeab. metanol)
4. Doble Caspr1 – MBP (cels fijadas, permeab. tritón 0,3%)
5. Doble Caspr1 – panNF (cels fijadas, permeab. metanol)
6. Doble Caspr1 – panNF (cels fijadas, permeab. tritón 0,3%)
7. Doble MRGPRD – NFh (cels fijadas, permeab. tritón 0,3%)

Protocolo: se hacen lavados con PBS1x entre cada uno de los pasos

• Cubre 1:
  • Incubar con anticuerpo anti-Caspr1 (ab34151) 1/200 diluído en medio NG mielinización: 1h a 37ºC
  • Fijar 20min con PFA 4%
  • Incubar con anticuerpo secundario GAR488 diluído 1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Montar con FLuoromount
• Cubre 2:
  • Fijar 20min con PFA 4%
  • Bloquear con Goat serum 5% y 0,3% tritón: 30min RT
  • Incubar con anticuerpo anti-Caspr1 (ab34151) 1/200 diluído en Goat serum 5%: overnight 4ºC
  • Incubar con anticuerpo secundario GAR488 diluído 1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Montar con FLuoromount
• Cubre 3:
  • Fijar 20min con PFA 4%
  • Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
  • Bloquear con Goat serum 5%: 30min RT
  • Incubar con anticuerpo anti–Caspr1 (ab34151) 1/200 diluído en Goat serum 5%: overnight 4ºC
  • Incubar con anticuerpo anti-MBP (808401) 1/200 diluído en Goat serum 5%: 1h RT
  • Incubar con anticuerpos secundarios GAR488 + GAM594 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Montar con FLuoromount
• Cubre 4:
  • Fijar 20min con PFA 4%
  • Bloquear con Goat serum 5% y 0,3% tritón: 30min RT
  • Incubar con anticuerpo anti-Caspr1 (ab34151) 1/200 diluído en Goat serum 5%: overnight 4ºC
  • Incubar con anticuerpo anti-MBP (808401) 1/200 diluído en Goat serum 5%: 1h RT
  • Incubar con anticuerpos secundarios GAR488 + GAM594 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Montar con FLuoromount
• Cubre 5:
  • Fijar 20min con PFA 4%
  • Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
  • Bloquear con Goat serum 5%: 30min RT
  • Incubar con anticuerpo anti-Caspr1 (ab34151) 1/200 diluído en Goat serum 5%: overnight 4ºC
  • Incubar con anticuerpo anti-panNF 1/200 diluído en Goat serum 5%: 1h RT
  • Incubar con anticuerpos secundarios GAR488 + GAC594 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Montar con FLuoromount
• Cubre 6:
  • Fijar 20min con PFA 4%
  • Bloquear con Goat serum 5% y 0,3% tritón: 30min RT
  • Incubar con anticuerpo anti-Caspr1 (ab34151) 1/200 diluído en Goat serum 5%: overnight 4ºC
  • Incubar con anticuerpo anti-panNF  1/200 diluído en Goat serum 5%: 1h RT
  • Incubar con anticuerpos secundarios GAR488 + GAC594 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Montar con FLuoromount
• Cubre 7:
  • Fijar 20min con PFA 4%
  • Bloquear con Goat serum 5% y 0,3% tritón: 30min RT
  • Incubar con anticuerpo anti-MRGPRD (HPA031346, Sigma) 1/100 diluído en Goat serum 5%: overnight 4ºC
  • Incubar con anticuerpo anti-NFh (AB5539) 1/500 diluído en Goat serum 5%: 1h RT
  • Incubar con anticuerpos secundarios GAR488 + GAC594 diluídos  1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
  • Montar con FLuoromount

Resultado:

• Las mejores condiciones son el cubre 3 y 5 (permeabilización con metanol): el marcaje de los anticuerpos es perfecto.
• El anticuerpo anti-Caspr1 (ab34151) marca también la mielina, aunque se ven claramente los paranodos (Elba lo prueba también en el teasing y se ven perfectos los paranodos).
• Aunque haya puesto las fotos de PN maduros, la mayoría de los nodos todavía no están maduros (los PN están muy separados).
• Cubre 7: el anticuerpo anti-MRGPRD no marca nada