2023.09.29: ELISA NF155 y NF186

Muestras:

• 23-2-698: titulación y subclases (NF155 y NF186)
• 23-2-725: titulación y subclases (NF155 y NF186)
• 23-2-930: titulación y subclases (NF155 y NF186)

Protocolo:

• Bloquear con leche 5% en PBS-tween 0’1% : 200 ul pozo (incubar 1h a temp. ambiente)
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Diluir los  sueros:
  • Titulación: preparar un tubo con 400 ul de suero diluído 1/100 en leche 5%, y poner en 5 tubos 280 ul de leche 5%. Pasar 140 ul de dilución del primer tubo al 2º tubo, y así sucesivamente hasta obtener las 6 diluciones (a: 1/100, b:1/300, c:1/900, d: 1/2700, e: 1/8100 i f: 1/24300)
  • Subclases:  diluir sueros 1/100 en leche 5% en PBS-tween 0’1%
• Incubar con los sueros 1h
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Ac secundarios:
  • Titulación / screening / confirmación: Incubar con RAH IgG HRP 1/3000 en leche 5% en PBS-tween 0’1% : 100 ul/pozo, 45 min
  • Subclases: Incubar con MAH HRP IgG1 o IgG2 o IgG3 o IgG4 1/1000 en leche 5% en PBS-tween 0’1%  : 100 ul/pozo, 45 min
• Lavar 3 veces con PBS-tween 0’1%
• Incubar 5min con TMB: preparar solución un rato antes y tapar de la luz (para que se atempere) : 100 ul/pozo
• Parar la reacción con 50ul de H₂SO₄ 25%
• Leer a 450-570 nm

NF155 1 ug/ml    NF186 3 ug/ml

Resultado: ELISA NF155 no ha salido bien… estará mal la proteína???

• 23-2-698: título NF186 1/100, subclase IgG2
• 23-2-725: título NF186 1/100, subclases no salen
• 23-2-930: título NF186 1/900, subclase IgG4