Cojo 4 cubres de los explantes DRG co-cultivos P/L:
- Doble MBP – panNF
- Doble MBP – Caspr1
- Triple MBP – panNF – NF200
- Triple MBP – Caspr1 – NFh
Protocolo:
- Fijar 20 min con PFA 4%
- 1 lavado con PBS1x
- Bloquear con Goat serum 5% y 0’3% tritón (en PBS): 1h a RT
- Incubar con anticuerpos primarios y secundarios diluídos en Goat serum 5% (sólo diluyo con GS5% tritón 0,3% el MBP). Hacer lavados entre cada paso:
- Cubre 1:
- MBP: SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : overnight 4ºC
- panNF: AF3235 (R&D systems). Dil.1/500 (chicken) : 2h RT
- GAM488 + GAC594: 1/500 : 1h RT
- Cubre 2:
- MBP: SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : overnight 4ºC
- Caspr1: ab133634 (abcam). Dil. 1/100 (rabbit) : 2h RT
- GAM488 + GAR594: 1/500 : 1h RT
- Cubre 3:
- MBP: SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : overnight 4ºC
- panNF: AF3235 (R&D systems). Dil.1/500 (chicken) : 2h RT
- NF200: anti-Neurofilament200, N4142 (Merck). Dil. 1/50 (rabbit): 1h RT
- GAM647 + GAR488 + GAC594: 1/500 : 1h RT
- Cubre 4:
- MBP: SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : overnight 4ºC
- Caspr1: ab133634 (abcam). Dil. 1/100 (rabbit) : 2h RT
- NFh: anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken) : 1h RT
- GAM647 + GAR488 + GAC594: 1/500 : 1h RT
- Cubre 1:
- 3 lavados con PBS1x
- Montar con Fluoromount
Resultado:
- Doble MBP – panNF: mucha mielina y panNF marca paranodos
- Doble MBP – Caspr1: Mucha mielina, pero Caspr1 no marca paranodos
- Triple MBP – panNF – NF200: La triple ICC ha salido perfecta: se ve mielina, paranodos y neuronas
- Triple MBP – Caspr1 – NFh: nose porque el 647 marcan los paranodos!!
En el microscopio de fluorescencia normal hay mucho cruce entre 594 y 647 (el 647 se cuela en el 594).
Intento hacer fotos a 100x con el microscopio normal y el marcaje 647 se va muy rápido: usar medio Prolong Gold antifade, y signal enhancer.
Fotos microscopio normal:
Fotos microscopio confocal:
