Objetivo: pasar 50 muestras de LCR de pacientes EM en HEKs transfectadas con GlialCAM vivas.
Muestras: LCR de EM
- EM-330
- EM-338
- EM-341
- EM-343
- EM-348
- EM-349
- EM-351
- EM-355
- EM-356
- EM-359
- EM-360
- EM-361
- EM-365
- EM-367
- EM-368
- EM-369
- EM-370
- EM-475
- EM-376
- EM-377
- EM-380
Protocolo cels vivas (sin fijar):
- Incubar con suero 1/100 o LCR 1/10 en medio HEK293 (1h a 37ºC): preparar 250 ul de cada muestra para cubrir el pozo (en el primer pozo poner solamente medio, en los otros 7 normal)
- 3 lavados con PBS1x
- Fijar 10 min con PFA4%
- 1 lavado con PBS1x y quitar la pieza de los culture slides
- Permeabilizar 5min con tritón 0,3% (en PBS1x)
- 1 lavado con PBS1x
- Incubar con anticuerpo comercial anti-CMYC diluído 1/200 en goat serum 5% (1h a RT) (solamente añadiremos el anticuerpo comercial en el primer pozo y en los otros pondremos solamente goat serum 5%)
- 3 lavados con PBS1x
- Incubar con Ac.secundarios GAM488 + GAH594 diluídos 1/750 en goat serum 5% (1h a RT) (el GAM488 solamente en el primer pozo, en los otros solo GAH594)
- 3 lavados PBS1x
- Montar con Fluoromount
Resultado: todas las muestras son negativas. GlialCAM bien transfectado (fotos)
