Objetivo: pasar 50 muestras de LCR de pacientes EM en HEKs transfectadas con GlialCAM vivas.
Muestras: LCR de EM
- EM-325
- EM-394
- EM-405
- EM-328
- EM-363
- EM-382
- EM-384
- EM-386
- EM-388
- EM-389
- EM-400
- EM-381
- EM-391
- EM-398
- EM-396
- EM-378
- EM-399
- EM-401
- EM-409
- EM-411
- EM-373
Protocolo cels vivas (sin fijar):
- Incubar con suero 1/100 o LCR 1/10 en medio HEK293 (1h a 37ºC): preparar 250 ul de cada muestra para cubrir el pozo (en el primer pozo poner solamente medio, en los otros 7 normal)
- 3 lavados con PBS1x
- Fijar 10 min con PFA4%
- 1 lavado con PBS1x y quitar la pieza de los culture slides
- Permeabilizar 5min con tritón 0,3% (en PBS1x)
- 1 lavado con PBS1x
- Incubar con anticuerpo comercial anti-CMYC diluído 1/200 en goat serum 5% (1h a RT) (solamente añadiremos el anticuerpo comercial en el primer pozo y en los otros pondremos solamente goat serum 5%)
- 3 lavados con PBS1x
- Incubar con Ac.secundarios GAM488 + GAH594 diluídos 1/750 en goat serum 5% (1h a RT) (el GAM488 solamente en el primer pozo, en los otros solo GAH594)
- 3 lavados PBS1x
- Montar con Fluoromount
Resultado: todas las muestras son negativas. GlialCAM bien transfectado.
