2023.08.14: ICC co-cultivos (día 24 – rata 20/07/2023)

Cojo cubres de todas las condiciones para ir viendo cómo va la diferenciación.

Protocolo:

• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear con Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS): 1h a RT (no me ha dado tiempo de bloquear y he hecho un bloqueo/tritón 5 min, y he puesto primero el NFh y después el MBP)
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón  (en PBS):
  • MBP y NFh
    • anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken) : 1h RT
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : (1h RT)
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (todos a 1/500)
  • MBP y NFh: GAM488 + GAC594
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado:

1. Explante DRG 01/06/23: marca todas las cels de Schwann… no se ve la mielina como siempre.
2. Explante médula 01/06/23: hay mielina
3. Médula disgregada 20/07/23 (tratada como co-cultivos): hay un poco de mielina
4. Explante DRG coating habitual 20/07/23 (Poly-D/laminina): hay un poco de mielina
5. Explante DRG matrigel 20/07/23: no hay mielina
6. DRG cels disgregadas matrigel 20/07/23: no se ve bien porque hay demasiadas capas de células!!! No hago foto