Cojo cubres de los co-cultivos para ir viendo cómo va la diferenciación:
- 1 cubre explantes DRG
- 1 cubre explantes médula
Protocolo:
- Fijar 20 min con PFA 4%
- 1 lavado con PBS1x
- Bloquear con Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS): 1h a RT
- Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS):
- MBP y NFh: los 2 juntos overnight 4ºC (cubres boca arriba en cajita puntas)
- anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse
- anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken)
- MBP y NFh: los 2 juntos overnight 4ºC (cubres boca arriba en cajita puntas)
- 3 lavados con PBS1x
- Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (todos a 1/500)
- MBP y NFh: GAM488 + GAC594
- 3 lavados con PBS1x
- Montar con Fluoromount
Resultado: no se ve mielina!!!