2023.03.23: Co-cultivo de neuronas DRG i células de Schwann (rata)

Co-cultivo de neuronas DRG i células de Schwann (rata)

Se extraen a partir de embriones de rata. Ratas Sprague-Dawley embarazadas.

Se piden ratas E15 pero se utilizan pasadas 24horas : el cultivo se inicia en E16.

Extracción de DRGs

• Estabulario
• Llevar al estabulario un tubo falcon de 50 ml con medio L15 (en hielo) y material instrumental (tijeras, bisturí, pinzas…).

Medio L15:

• 45 ml de medio Leibovitz’s
• 5 ml de FBS (10%)
• Poner el animal a la cámara de CO₂ : abrir la llave hasta el número 2, subir el O₂ hasta el 2, y poner el  isofluorano al 5.
• Sacar la rata de la cámara y ponerla encima de un corcho. Pinchar 1ml de TP41 (Solución inyectable para eutanasia) en el corazón.
• Mojar la rata con alcohol y abrir por debajo (ponerla boca arriba). Tirar de las bolsas de los fetos y ponerlos en una placa con L15.
• Sacar todos los fetos de las bolsas y ponerlos en un tubo con medio L15 (en hielo).
• Cultivos
• Poner todos los fetos en una placa con el medio L15 y mantenerla sobre el hielo.
• Coger un feto, ponerlo sobre la placa con Agar y mojarlo con PBS (estéril y frío, mantenerlo en hielo). Es importante ir mojando el feto con PBS, no puede quedarse seco en ningún momento.
• Cortar la cabeza con unas tijeras y clavar el feto boca abajo con 4 puntas de aguja en las extremidades.
• Sacar las dos capas que envuelven la medula espinal y sacar la médula procurando que no se rompa.
• Sacar los ganglios que se hayan quedado pegados a la médula y pasarlos a una placa pequeña con L15.
• Con una aguja de insulina sacar para fuera los DRG de la columna e irlos pasando a la placa con L15

Co-cultivos

• 4 placas de 24wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo, y 6 culture slides:
  • Día anterior: coating con Poly-D-lys 1/40 : incubar overnight a 37ºC
  • Mismo día: lavar pozos y hacer coating con Laminina 2’5 ul/ml : incubar mínimo 1h a 37ºC
• D0 : Añadir 400 ul de medio C (co-culture medium) a cada pozo con cubre:
  • Medio C (co-culture medium):
    • DMEM (con D-glucosa y Glutamax): 44,5 ml (ref. 10569-010 ThermoFisher)
    • 10% FBS: 5 ml
    • 1% Pen-Str: 0,5ml
    • 50 ng/ml NGF: 25 ul
• Poner un DRG en cada pozo/cubre e incubar a 37ºC
• D3 : cambiar el medio (poner medio NG) 500 ul/pozo
  • Neurobasal: 48 ml
  • 2% B27: 1 ml
  • 1% L-glutamina (en este caso, Glutamax): 0,5 ml
  • 1% Pen-Str: 0,5 ml
  • 50 ng/ml NGF:25 ul
• D5 : cambiar el medio (poner medio NG nuevo) : cambio 250 ul (la mitad)
• D7 : cambiar el medio por Medio de mielinización co-cultivos:
  • Medio C: 30 ml
  • 50 ug/ml de ácido ascórbico: 300 ul del stock 5mg/ml (1/100 en el medio)
  • 0,5 uM Forskolin: 1,5ul del stock 10mM (1/20000 en el medio)
• D8 : cambiar el medio (poner medio de mielinización nuevo) : a partir de aquí ir cambiando un día sí uno no (cada 2 días).