2023.03.14 ICC co-cultivos (día 40-2, rata 02.02.2023)

Objetivo: probar cómo se ven los co-cultivos en culture slides.

Uso 1 culture slide crecido con medio de mielinización 1.

Muestras/anticuerpos:

1. NF200 – MBP
2. NF200 – MBP
3. Caspr1 – MBP
4. panNF – MBP
5. suero CIDP15 (GDP) – MBP
6. suero CIDP78 (MRVM) – MBP
7. LCR GDP – MBP
8. suero Cneg 204-11 – MBP

Protocolo:

• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear 30 min con Goat serum 5% tritón 0,5%
• Incubar con anticuerpos primarios o suero diluídos en Goat serum 5% tritón 0’5%
  • 1-2:
    • NF200: anti-Neurofilament200, N4142 (Merck). Dil. 1/50 (rabbit) : 1h RT
    • MBP anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : 1h RT
  • 3:
    • Caspr1: anti-Caspr1, abcam. Dil. 1/100 (rabbit) : 1h RT
    •  MBP anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : 1h RT
  • 4:
    • panNF: anti-panNeurofascin. Dil. 1/100 (chicken) : 1h RT
    • MBP anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : 1h RT
  • 5-8:
    • Sueros dil. 1/60 o LCR dil. 1/100 : 1h RT
    • MBP anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse) : 1h RT
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% tritón 0’5%(todos a 1/500)
  • 1-2: GAR488 (NF200) + GAM594 (MBP)
  • 3: GAR488 (Caspr1) + GAM594 (MBP)
  • 4: GAC488 (panNF) + GAM594 (MBP)
  • 5-8: GAH488 IgG (suero) + GAM594 (MBP)
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado: en general hay demasiadas células y no hay mielina… El anticuerpo NF200 nuevo funciona bien, aunque sigue funcionando mucho mejor el NfH chicken.