2023.03.07 ICC co-cultivos (día 33 – rata 02.02.2023)

Objetivo: pasar los pacientes positivos que tengamos para ver cómo es el marcaje.

Uso 22 cubres de las placas con medio de mielinización 1:

Muestras:

1. CIDP15 (GDP1, LIF+)
2. CIDP15 (GDP1, LIF+)
3. 151-21 (GDP2)
4. 151-21 (GDP2)
5. CIDP78 (MRVM 1ª muestra , LIF+ CASPR1+)
6. CIDP78 (MRVM 1ª muestra 21/11/11 , LIF+ CASPR1+)
7. 179-06 (MRVM 26/08/15)
8. 179-06 (MRVM 26/08/15)
9. 22-3-414 Box 295 (Bocanegra 1ª muestra Plasma, CASPR1+)
10. 23-234205 (Bocanegra 20/02/23 CASPR1neg)
11. CIDP16 (JCDHM, NF155+)
12. CIDP18 (ESG, NF155+)
13. CIDP21 (RDP, panNF+)
14. CIDP44 (TMF, CNTN1+)
15. Cneg 21-2-1608
16. Cneg 204-10
17. Cneg 204-11
18. CIDP50 (JMG, NF155+)
19. 21-2-94 (X4069 CNTN1+)
20. CIDP80 (JMSM, NF155+)
21. Triple ICC: NFh (antiguo), MBP, CASPR1 (caspr1 en vivo overnight 1/100)
22. Tripe ICC: neurofilament200(nuevo), MBP, panNF (panNF en vivo overnight 1/100)  

Protocolo:

• Incubar con suero 1/100 en medio de mielinización 1 :24h 37ºC
• 1 lavado con PBS1x
• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear 30 min con Goat serum 5% tritón 0’5%
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% tritón 0’5% (1h RT)
  • 1-20: MBP anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/300 (mouse)
  • 21: MBP y NFh
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/300 (mouse)
    • anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken)
  • 22: MBP y NF200
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/300 (mouse)
    • anti-Neurofilament200, N4142 (Merck). Dil. 1/50 (rabbit)
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% tritón 0’5%(todos a 1/500)
  • 1-20 : GAH488 IgG (suero) + GAM594 (MBP)
  • 21 : GAM647 (MBP) + GAC488 (NfH) + GAR594 (Caspr1)
  • 22 : GAM647 (MBP) + GAC488 (panNF) + GAR594 (NF200)
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado:

• Prácticamente no se ve la mielina : sin embargo sí que está porque en algunos cubres se ve muy muy débil : algo sucede con la ICC con anti-MBP
• En las ICC triples no se ve nada con el anticuerpo GAM647
• El neurofilament200 se ve mucho peor que el neurofilament H.