Muestras:
- DNA CNTN1-1 (antiguo CNTN1-1) : Maria Rosa Soldati (EDTA)
- DNA CNTN1-6 (antiguo CNTN1-6) : BIO040 (EDTA)
- DNA CNTN1-7 (antiguo CNTN1-7) : BIO050 (EDTA)
- DNA CNTN1-15 (antiguo CNTN1-39) : Manfred Eduard Nadolph (pellet leucocitos)
- DNA CNTN1-16 (antiguo CNTN1-40) : Josef Rathgeb (pellet leucocitos)
- DNA CASPR1-2 : Helmut Willnauer (pellet leucocitos)
- DNA CNTN1-CASPR1 – 3 : Helmut Beza (pellet leucocitos)
Protocolo: QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen), protocol DNA purification from blood or body fluids (spin protocol) : protocol para purificar DNA de sangre, plasma, suero, linfocitos y otros fluídos corporales.
Cosas a hacer antes de empezar:
- Equilibrar muestras a temperatura ambiente (15-25 ºC)
- Calentar el baño o el bloque seco a 56ºC
- Equilibrar el Buffer AE a temperatura ambiente
- Si hay precipitado en el Buffer AL, disolver incubándolo a 56ºC.
Protocolo:
- Poner 20 ul de Qiagen Protease en un eppendorf vacío
- Añadir 200 ul de muestra al eppendorf (si la muestra son leucocitos, añadir 200 ul de PBS1x a las células)
- Añadir 200 ul de Buffer AL. Mezclar con vórtex 15s.
- Incubar a 56ºC 10 min
- Centrifugar brevemente los tubos para eliminar las burbujas
- Añadir 200 ul de etanol (96-100%) y mezclar con vórtex 15s.
- Pasar toda la mezcla a una QIAamp Mini spin column y centrifugar 1min a 6000g. Poner la columna en un nuevo collection tube y descartar el tubo anterior.
- Añadir 500 ul de Buffer AW1 a la columna. Centrifugar 1min a 6000g. Poner la columna en un nuevo collection tube y descartar el tubo anterior.
- Añadir 500 ul de Buffer AW2, y centrifugar 3min a máxima velocidad.
- Eliminar el líquido del collection tube y volver a centrifugar 1min a máxima velocidad.
- Poner la columna en un eppendorf y añadir 50 ul de Buffer AE a la columna.
- Incubar a temperatura ambiente 5min y centrifugar 1min a 6000g
- Cuantificar el DNA.
Resultado:
- DNA CNTN1-1 (antiguo CNTN1-1) : 40,1 ng/ul
- DNA CNTN1-6 (antiguo CNTN1-6) : 22,6 ng/ul
- DNA CNTN1-7 (antiguo CNTN1-7) : 20,3 ng/ul
- DNA CNTN1-15 (antiguo CNTN1-39) : 12,3 ng/ul
- DNA CNTN1-16 (antiguo CNTN1-40) : 53,6 ng/ul
- DNA CASPR1-2 : 55,5 ng/ul
- DNA CNTN1-CASPR1 – 3 : 57,8 ng/ul
