Mostra: Pacient CIDP post-IVIg –> XZ (NHC: 1787443, DN: 11.04.1983)
EXTRACCIÓ DE PBMCs
- Extreure 6 tubs CPT + 1 tub suero (per guardar). Centrifugar 20 minuts a 1650 g sense fre a temperatura ambient.
- Invertir els tubs per resuspendre les cèl·lules al plasma i decantar els sobrenadants a un tub de 50 ml.
- Rentar amb suero fisiològic en una proporció 1:1 i centrifugar durant 5 minuts a 300g amb acceleració i fre.
- Treure el sobrenedant i fer un altre rentat amb suero fisiològic (posar 40 ml de suero).
- Centrifugar 5 minuts a 300 g amb acceleració i fre, i treure el sobrenedant.
- Ressuspendre el pellet en 2 ml de B cell isolation medium
- 2% de FBS: 500 µl
- 1 mM d’EDTA: 50 µl de EDTA 0’5M
- 24’5 ml de PBS
- Fer recompte cel·lular –> 100 milions de PBMC.
*Congelo 40 milions de PBMC (4 vials):
- Centrifugar 5 minuts a 300 g i treure el sobrenedant.
- Ressuspendre en medi de congelació (FBS + DMSO 10 %): passar a criotub i congelar amb cryofreezer.
SEPARACIÓ DE CÈL·LULES B
S’utilitza el kit “EasySep negative selection Human B-cell enrichment kit” (190549, Stemcell Technologies).
- Preparar la suspensió cel·lular a una concentració de 5×107 cèls/ml (en Bcell isolation medium): les cèl·lules s’han de posar a un tub de 5 ml de polyestirene (tap de doble tancament) –> 1 ml
- Afegir 75 µl de Human B Cell Enrichment Cocktail cada ml de suspensió cel·lular. Barrejar bé i incubar a temperatura ambient durant 10 minuts. –> 75 µl
- Afegir 75 µl de D Magnetic Particles cada ml de suspensió cel·lular. Barrejar bé i incubar a temperatura ambient durant 5 minuts. –> 75 µl
- Afegir Bcell isolation medium fins a un volum total de 2,5 ml.
- Posar el tub (sense tap) dins de l’imant lila. Deixar 5 minuts.
- Invertir l’imant (in one continous motion) i passar el contingut del tub a un altre tub de 5 ml amb doble tancament
- Fer recompte cel·lular –> 2’3 milions cèls B
CULTIU I ESTIMULACIÓ DE CÈLS B
Cultivar les cèls a una densitat de 2’5×106 cèls/ml –> en aquest cas, resuspendre cèls en 900 µl de medi: agafar 300 µl per citometria i 600 µl per cultivar
Medi de cultiu de cèl·lules B (25 ml totals):
- 24,5 ml de RPMI
- 1 % de Penicil·lina-Streptomicina: 250 µl
- 1 % de L-glutamina: 250 µl
- DIA 0: centrifugar les cèls 5 mins a 300g i resuspendre-les en medi de cultiu de cèls B + 3 µg/ml de CpG-B + 10 µg/ml de GAH IgA+IgG+IgM.
- Deixar les cèl·lules en cultiu (als dos tubs) durant 48 hores (37ºC, 5 % CO2)
- A les 48 hores fer citometria
CITOMETRIA
- Als 100 µl de cada mostra afegir 100 µl de medi i separar en dos tubs diferents.
- Tub 1: Incubar 100 µl de cada mostra amb la mix d’anticossos durant 15 minuts a temperatura ambient (tapat de la llum).
- 5 µl CD19-PC5
- 2 µl CD27-PC7
- 20 µl CD38-PE
- 2 µl CD24-Viogreen
- 2 µl IgD-FITC
- 5 µl Vivid-Vioblue
- Tub 2 (IL10):
- Afegir 10 µl de IL-10 Catch Reagent als 100 µl de cada mostra. Incubar 5 minuts en gel
- Afegir 1 ml de medi de cèls B (atemperat)
- Incubar 45 minuts a 37ºC en agitació
- Posar el tub en gel i afegir 1 ml de Buffer IL10 (50 ml de PBS + 200 µl EDTA 0,5M + 0,25g BSA)
- Centrifugar 10 minuts a 400g a 4ºC
- Treure el sobrenedant i afegir 100 µl de buffer IL10
- Incubar amb la mix d’anticossos durant 15 minuts en gel (tapat de la llum)
- 5 µl CD19 – PC5
- 10 µl IL10 – PE
- 5 µl Vivid -Vioblue
- Afegir 1 ml de PBS a cada tub i centrifugar (5 mins a 400 g a 4ºC)
- Eliminar sobrenedant i resuspendre amb 100 µl de PBS + 100 µl de PFA 4 %
- Analitzar amb el citòmetre