20200211 – 20200213: B cells study (CIDP patient XZ pre-IVIg)

Mostra: Pacient CIDP pre-IVIg –> XZ (NHC: 1787443, DN: 11.04.1983)

EXTRACCIÓ DE PBMCs

1. Extreure 6 tubs CPT + 2 tubs suero (per guardar). Centrifugar 20 minuts a 1650 g sense fre a temperatura ambient.
2. Invertir els tubs per resuspendre les cèl·lules al plasma i decantar els sobrenadants a un tub de 50 ml.
3. Rentar amb suero fisiològic en una proporció 1:1 i centrifugar durant 5 minuts a 300g amb acceleració i fre.
4. Treure el sobrenedant i fer un altre rentat amb suero fisiològic (posar 40 ml de suero).
5. Centrifugar 5 minuts a 300 g amb acceleració i fre, i treure el sobrenedant.
6. Ressuspendre el pellet en 2 ml de B cell isolation medium
   • 2% de FBS: 500 µl
   • 1 mM d’EDTA: 50 µl de EDTA 0’5M
   • 24’5 ml de PBS
7. Fer recompte cel·lular –> 80 milions de PBMC.

*Congelo 30 milions de PBMC (3 vials):

• Centrifugar 5 minuts a 300 g i treure el sobrenedant.
• Ressuspendre en medi de congelació (FBS + DMSO 10 %): passar a criotub i congelar amb cryofreezer.

SEPARACIÓ DE CÈL·LULES B

S’utilitza el kit “EasySep negative selection Human B-cell enrichment kit” (190549, Stemcell Technologies).

1. Preparar la suspensió cel·lular a una concentració de 5×10⁷ cèls/ml (en Bcell isolation medium): les cèl·lules s’han de posar a un tub de 5 ml de polyestirene (tap de doble tancament) –> 1 ml
2. Afegir 75 µl de Human B Cell Enrichment Cocktail cada ml de suspensió cel·lular. Barrejar bé i incubar a temperatura ambient durant 10 minuts. –> 75 µl
3. Afegir 75 µl de D Magnetic Particles cada ml de suspensió cel·lular. Barrejar bé i incubar a temperatura ambient durant 5 minuts. –> 75 µl
4. Afegir Bcell isolation medium fins a un volum total de 2,5 ml.
5. Posar el tub (sense tap) dins de l’imant lila. Deixar 5 minuts.
6. Invertir l’imant (in one continous motion) i passar el contingut del tub a un altre tub de 5 ml amb doble tancament
7. Fer recompte cel·lular –> 1’2 milions cèls B

CULTIU I ESTIMULACIÓ DE CÈLS B

Cultivar les cèls a una densitat de 2’5×10⁶ cèls/ml –> en aquest cas, resuspendre cèls en 500 µl de medi: agafar 250 µl per citometria i 250 µl per cultivar

Medi de cultiu de cèl·lules B (25 ml totals):

• 24,5 ml de RPMI
• 1 % de Penicil·lina-Streptomicina: 250 µl
• 1 % de L-glutamina: 250 µl

1. DIA 0: centrifugar les cèls 5 mins a 300g i resuspendre-les en medi de cultiu de cèls B + 3 µg/ml de CpG-B + 10 µg/ml de GAH IgA+IgG+IgM.
2. Deixar les cèl·lules en cultiu (als dos tubs) durant 48 hores (37ºC, 5 % CO₂)
3. A les 48 hores fer citometria

CITOMETRIA

1. Als 100 µl de cada mostra afegir 100 µl de medi i separar en dos tubs diferents.
2. Tub 1: Incubar 100 µl de cada mostra amb la mix d’anticossos durant 15 minuts a temperatura ambient (tapat de la llum).
   1. 5 µl CD19-PC5
   2. 2 µl CD27-PC7
   3. 20 µl CD38-PE
   4. 2 µl CD24-Viogreen
   5. 2 µl IgD-FITC
   6. 5 µl Vivid-Vioblue
3. Tub 2 (IL10):
   1. Afegir 10 µl de IL-10 Catch Reagent als 100 µl de cada mostra. Incubar 5 minuts en gel
   2. Afegir 1 ml de medi de cèls B (atemperat)
   3. Incubar 45 minuts a 37ºC en agitació
   4. Posar el tub en gel i afegir 1 ml de Buffer IL10 (50 ml de PBS + 200 µl EDTA 0,5M + 0,25g BSA)
   5. Centrifugar 10 minuts a 400g a 4ºC
   6. Treure el sobrenedant i afegir 100 µl de buffer IL10
   7. Incubar amb la mix d’anticossos durant 15 minuts en gel (tapat de la llum)
      1. 5 µl CD19 – PC5
      2. 10 µl IL10 – PE
      3. 5 µl Vivid -Vioblue
4. Afegir 1 ml de PBS a cada tub i centrifugar (5 mins a 400 g a 4ºC)
5. Eliminar sobrenedant i resuspendre amb 100 µl de PBS + 100 µl de PFA 4 %
6. Analitzar amb el citòmetre