20180507 – 20180514: Diferenciación de células HTB-11 (prueba 2)

Diferenciació HTB-11 a neurones

*Medi HTB11:

• 1 % Penicil·lina-Streptomicina
• 1 % Sodium Pyruvate
• 1 % L-glutamina
• FBS (segons el percentatge)
• DMEM

Dia 0 –> Sembrar cèl·lules

• Fer coating amb Poly-D-Lysine + Laminin –> 2 plaques de 12 wells
  • Poly-D-Lysine (1 mg/ml) 1/40 amb PBS –> 1 h a 37ºC
  • 2 rentats amb PBS
  • Laminin (1’2 mg/ml) 2 µl/ml PBS –> 1 h a 37ºC
  • 2 rentats amb PBS
• Sembrar 5000 cèls/cm²
  • Cada pou té 3’65 cm^{2  :   a}prox 18500 cèls/pou (1’5 ml de medi/pou)

Dia 1 –> Tractament

• Àcid retinoic (RA) 10 µM –> Stock solution -80ºC (diluït en etanol 96%): 0,01 M –> es fa 1 µl en 1 ml de medi
  • 2 pous 10 % FBS –> 3 µl RA + 3 ml
  • 2 pous 3 % FBS –> 3 µl RA + 3 ml
  • 2 pous sense FBS –> 3 µl RA + 3 ml

• Àcid retinoic (RA) 5 µM + Colesterol (Chol) 5 µg/ml –> Stock solution chol -80ºC (diluït en etanol 96 %): 5 mg/ml –> es fa 1 µl en 1 ml de medi.
  • 2 pous 10 % FBS –>1’5 µl RA + 3 µl Chol + 3 ml
  • 2 pous 3 % FBS –> 1’5 µl RA + 3 µl Chol + 3 ml
  • 2 pous sense FBS –> 1’5 µl RA + 3 µl Chol + 3 ml

•  NGF 100 ng/ml –> Stock -20ºC (vial mare) a 100 µg/ml
  • 2 pous 10 % FBS –> 3 µl NGF + 3 ml
  • 2 pous 3 % FBS –> 3 µl NGF + 3 ml
  • 2 pous sense FBS –> 3 µl NGF + 3 ml

• Control negatiu
  • 2 pous 10 % FBS
  • 2 pous 3 % FBS
  • 2 pous sense FBS

Dia 3:  Canvi medi + tractament

Mateixes condicions que DIA 1.

Ja s’observen clares diferències entre les diferents condicions. La condició en la que s’observa major diferenciació és: RA 10 µM en medi sense FBS.

Fotografies:

Dia 7:  

• Les cèl·lules dels pous sense FBS estan pràcticament totes mortes –> diferencien però després moren.
• Les cèl·lules dels pous amb 3 % de FBS estan molt crescudes i bastant diferenciades (amb RA).
• Les cèl·lules dels pous amb 10 % de FBS estan massa crescudes (no tenen lloc per diferenciar).