20180423 – 20180503: Diferenciación de células HTB-11 (prueba)

Diferenciació HTB-11 a neurones

Dia 0 –>  Sembrar cèl·lules

• Sembrar a placa de 24 pous 5000 cèls/cm² (coating amb gelatina 0’15 %)
  • Cada pou té 1’82 cm^{2 –>} aprox 10000 cèls/pou (1 ml de medi/pou) –> es faran 20 pous (200.000 cèls)

Dia 1 –> tractament

• Àcid retinoic (RA) 10 µM
  • Stock solution -80ºC (diluït en etanol 96%): 0,01 M –> es fa 1 µl en 1 ml de medi. *Preparar 5’5 µl de solució stock en 5’5 ml de medi.

• Colesterol (Chol) 10 µg/ml
  • Stock solution -80ºC (diluït en etanol 96 %): 5 mg/ml –> es fa 2 µl en 1 ml de medi. *Preparar 11 µl de solució stock en 5’5 ml de medi.

• Àcid retinoic (RA) 5 µM + Colesterol (Chol) 5 µg/ml
  • 0’5 µl de RA + 0’5 µl de Chol en 1 ml de medi. *Preparar 3 µl RA +  3 µl Chol en 6 ml de medi.
• Control negatiu: etanol 96º 1 µl/ml medi. *Preparar 5’5 µl en 5’5 ml de medi.

Dia 3:

• Treure un cubre de cada condició i fer ICC de neurofilament:
  • Fixar amb PFA 4 % durant 10 minuts
  • Bloqueig: Goat Serum 5 % 1h
  • Ac primari –> anti-neurofilament -L clone EP675Y, rabbit monoclonal antibody (04-1112, Millipore). Dilució 1/500
  • Rentats PBS
  • Ac secundari –> GAR 488 1/1000
  • Rentats PBS
  • Muntar amb Vectashield

RESULTAT ICC dia 3:  no s’observen diferències entre les diferents condicions.

• Canvi de medi + tractament:
  • Àcid retinoic (RA) 10 µM –> 4’5 µl de solució stock en 4’5 ml de medi.
  • Colesterol (Chol) 10 µg/ml –> 4’5 µl de solució stock en 4’5 ml de medi.
  • Àcid retinoic (RA) 5 µM + Colesterol (Chol) 5 µg/ml –> 2’5 µl RA + 2’5 µl Chol en 5 ml de medi.
  • Control negatiu: etanol 96º 1 µl/ml medi –> 4’5 µl en 4’5 ml de medi.

Dia 7:

• Treure un cubre de cada condició i fer ICC de neurofilament:
  • Fixar amb PFA 4 % durant 10 minuts
  • Bloqueig: Goat Serum 5 % 1h
  • Ac primari –> anti-neurofilament -L clone EP675Y, rabbit monoclonal antibody (04-1112, Millipore). Dilució 1/1000
  • Rentats PBS
  • Ac secundari –> GAR 488 1/1000
  • Rentats PBS
  • Muntar amb Vectashield

RESULTAT ICC dia 7:  no s’observen diferències entre les diferents condicions.

• Canvi de medi + tractament:
  • Àcid retinoic (RA) 10 µM –> 3’5 µl de solució stock en 3’5 ml de medi.
  • Colesterol (Chol) 10 µg/ml –> 3’5 µl de solució stock en 3’5 ml de medi.
  • Àcid retinoic (RA) 5 µM + Colesterol (Chol) 5 µg/ml –> 3’5 µl RA + 3’5 µl Chol en 5 ml de medi.
  • Control negatiu: etanol 96º 1 µl/ml medi –> 3’5 µl en 3’5 ml de medi.

Dia 9:

No s’ha pogut acabar l’experiment perquè totes les cèl·lules estaven mortes. La bombona de CO2 estava tancada. Repetir l’experiment canviant condicions (perquè no s’havia vist cap diferència entre els diferents tractaments).