20170425 ICQ IgG e IgM GDRs rata GBS-Zika y otras muestras (Unzue y ruso)

Se analizan por neuronas de GDRs de rata por  IgM (suero 1/40) e IgG (1/150) las muestras de pacientes  de SGB con Zika  y de dos pacientes de la unidad

PACIENTES

• 97 (Z001)
• 62 (Z002)
• 61 (Z003)
• 87 (Z004)
• 172-10  Andrey Vinogradov
• 17-121 Juan Carlos Unzue Labiano

Nota: como sobraba un cubre, adicionalmente para el análisis de IgM se ha analizadao la tinción de células sólo con anticuerpo secundario sin adición de suero.

PROTOCOLO

PRIMARIO:

• Sacar 300ul de medio del propio cultivo y añadirle 2ul (IgG) o 7,5 (IgM)* de suero del paciente en cada uno de los pocillos de placa de 12 donde haremos la inmuno. Mezclar bien con pipeta procurando no hacer espuma y colocar el cubre en el fondo del pocillo de una placa de 12 pocillos vigilando que quede bien cubierto. Incubar 1h a 37ºC (estufa).

*Las inmunos de IgM se han hecho con placas de 24 pocillos para optimizar el volumen de muestra. Para ello la dilución 1/40 se ha hecho con 5 mcL de muestra en 200 mcL de medio de cultivo.

FIJADO:

• Vaciar el pocillo  lavar una vez con PBS 1X. Fijar con PFA comercial al 4% (aprox 300ul de PFA/pocillo) 5 min a temperatura ambiente.

• Eliminar el PFA y lavar una vez con PBS 1X.

SEGUNDARIO:

• Eliminar el PBS y añadir 300 mcL de el secundario GAH 488 IgM o IgG 1:1500 en Goat serum al 5%. Incubar 1h a temperatura ambiente.

• Lavar cada cubre con H2O y montarlo sobre un porta con Vectashield.

RESULTADOS

Nota: como sobraba un cubre, adicionalmente para el análisis de IgM se ha analizadao la tinción de células sólo con anticuerpo secundario sin adición de suero. El resultado ha sido totalmente negativo, confirmando así la especificidad del mismo.