2024.01.11: Co-cultivo de neuronas DRG i células de Schwann (rata)

Coating placas para co-cultivos y neuronas

Placas: coating Poly-D-lys/laminina

• Explantes DRG:  6 placas de 24 wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo à coating Poly-D-lys/laminina
• Médula disgregada (co–cultivos): 3 placas 60 cc con 26 cubres 9mm

Protocolo coating Poly-D-lys/laminina:

• Coating con Poly-D-lys 1/40 : incubar 2h a 37ºC
• Lavar 1 vez con PBS1x
• Coating con laminina  3 ul/ml: incubar 1h a 37ºC
• Lavar 1 vez con PBS1x

Co-cultivo de neuronas DRG i células de Schwann (rata)

Se extraen a partir de embriones de rata. Ratas Sprague-Dawley embarazadas.

Se piden ratas E15 pero se utilizan pasadas 24horas : el cultivo se inicia en E16.

Extracción de DRGs

• Estabulario
• Llevar al estabulario un tubo falcon de 50 ml con medio L15 (en hielo) y material instrumental (tijeras, bisturí, pinzas…).

Medio L15:

• 45 ml de medio Leibovitz’s
• 5 ml de FBS (10%)
• Poner el animal a la cámara de CO₂ : abrir la llave hasta el número 2, subir el O₂ hasta el 2, y poner el  isofluorano al 5.
• Sacar la rata de la cámara y ponerla encima de un corcho. Pinchar 1ml de TP41 (Solución inyectable para eutanasia) en el corazón.
• Mojar la rata con alcohol y abrir por debajo (ponerla boca arriba). Tirar de las bolsas de los fetos y ponerlos en una placa con L15.
• Sacar todos los fetos de las bolsas y ponerlos en un tubo con medio L15 (en hielo).
• Cultivos
• Poner todos los fetos en una placa con el medio L15 y mantenerla sobre el hielo.
• Coger un feto, ponerlo sobre la placa con Agar y mojarlo con PBS (estéril y frío, mantenerlo en hielo). Es importante ir mojando el feto con PBS, no puede quedarse seco en ningún momento.
• Cortar la cabeza con unas tijeras y clavar el feto boca abajo con 4 puntas de aguja en las extremidades.
• Sacar las dos capas que envuelven la medula espinal y sacar la médula procurando que no se rompa.
• Sacar los ganglios que se hayan quedado pegados a la médula y pasarlos a una placa pequeña con L15.
• Con una aguja de insulina sacar para fuera los DRG de la columna e irlos pasando a la placa con L15

Co-cultivos (explantes DRG)

• D0 : Añadir 450 ul de medio NG (co-culture medium) a cada pozo con cubre:
  • Medio NG:
    • 48 ml de medio Neurobasal
    • 1 ml de suplement B27
    • 500 µl de glutamax
    • 500 µl de Pen-Str
    • 25 µl de NGF
• Poner un DRG o trocito de médula en cada pozo/cubre e incubar a 37ºC