Objetivo: incubar las células con los sueros durante 1 semana e ir añadiendo cada día suero nuevo (repetición similar a experimento D del día 11/12/23)
Muestras:
- Cneg 206-1
- Cneg 206-2
- Cneg 206-6
- CASPR1+ 136-8 (Vinuesa)
- CASPR1+ 22-2-374 (Bocanegra)
- CASPR1+ 23-2-656 (Blanco)
- NF155+ 212-14 (Morón)
- NF155+ 216-17 (De Haro)
- NF155+ 167-1 (Marcet)
Protocolo ICC cels vivas (día 17/01/2024): entre cada paso hacer lavados con PBS1x
- Incubar con sueros diluídos 1/100 en medio NG mielinización a 37ºC (preparo 5 en 500 ul)
- Para añadir suero cada 24h: preparo 2,5ul de suero en 250ul de medio NG, quito 250ul de medio NG de las células y pongo los nuevos 250ul.
- Fijar con PFA4% 20min
- Permeabilizar 10min con metanol -20ºC
- Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 2h a RT (los pongo juntos)
- anti–Caspr1 (ab34151) 1/200
- anti-MBP (808401) 1/200
- Incubar con anticuerpos secundarios: GAR594 + GAM488 diluídos 1/500 en Goat serum 5%: 1h RT.
- Montar con Fluoromount
Resultado (día 17/01/2024): no veo mucha diferencia entre las células incubadas con CASPR1+ y las células incubadas con controles negativos (no hay muchos paranodos rotos…) De todos modos, hago la digitalización de los cubres para poder hacer el recuento y saber si hay o no diferencias.
