Objetivo: tratar de ver marcaje en los paranodos con muestras Caspr1+
Muestras:
- IgG 136-8
- IgG 22-2-374
- IgG 23-2-554
- IgG 23-2-656
- Cneg 201-9 suero
Protocolo cels fijadas: entre cada paso hacer lavados con PBS1x
- Fijar 20min con PFA 4%
- Permeabilizar 10min con acetona -20ºC
- Bloquear con Goat serum 5%: 30min RT
- Incubar con IgG 1/5 diluído en Goat serum 5%: overnight 4ºC
- Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5%: 1h a RT (los pongo juntos)
- anti–Caspr1 (ab34151) 1/200
- anti-MBP (808401) 1/200
- Incubar con anticuerpos secundarios GAH594 IgG + GAR488 + GAM647 diluídos 1/500 en Goat serum 5%: 1h RT
- Montar con Fluoromount
Resultado: aunque el marcage de MBP y Caspr1 se ve muy bien, no se ven los paranodos con los sueros!! La Acetona deshace el plástico de las placas de 24w, así que mejor usar metanol como hasta ahora.
Repetir haciendo las ICC vivas! Directamente fijar con metanol -20ºC 10min (no hace falta fijar primero con PFA4%).
