PROTOCOLO habitual de trasfección en CUTURE SLIDES. Retrotransfección durante 24h
Día 1. PolyD
Día 2. tranfección
plantar 150.000 cel/pocillo + 300ul medio (esta vez pongo más células porque la última vez había pocas células)
Para 2 cultureslides –> 4,4 ug MRGPRD (0.815ug/ul) –> 5,4ul + 136 optimen
Para 2 cultureslides –>4,4ug GPR57 (0.891 ug/ul) –> 4,9ul + 136 optimen
Lipo 12,8ul + optimen 272ul
–> añadir 15ul/pocillo
Día 3. Inmunos fijadas PFA4% 10 min, y del 1-8 permeabilizadas con PBS triton 0.3% 5 min, y muestras 8-16 sin permeabilizar (para ambos plásmidos)
Bloqueo goat 5% 1h
Muestras suero total 1/100 (50ul) 1h
Primario comercial MRGPRD 1/200, DDK 1/500
Cambio el secundario anti-human y uso el GAH488 para ver si el marcaje que parece inespecífico puede estar relacionado con el anticuerpo secundario
Resultados: veo marcaje inespecífico en todas las muestras para ambos plásmidos, independiente de la permeabilización. El anticuerpo comercial MRGPRD marca algunas células. El anti-DDK no marca, es posible que sea porque lo he diluido mas que anteriormente (1/500)
