2023.10.03: ICC co-cultivos IgG sueros CASPR1+ (día 74 – rata 20/07/2023)

Cojo 1 Culture Slide de DRG co-cultivos 20/07/23 para ver si puedo mejorar el marcaje de los paranodos, también cojo el único cubre que quedaba.

Protocolo: uso el mismo protocolo que el paper de Labasque 2014

• Fijar 20min con PFA4%
• 2 lavados con PBS1x
• Bloquear 30 min con (el cubre con GS5% tritón 0,3%):

• Incubar diluyendo en lo que vaya cada pozo:

1. IgG 136-8 1/10 : 1h RT, MBP 1/100 : 3h RT
2. MBP 1/100 , Caspr1 1/100 : 3h RT
3. IgG 23-2-656 1/10 : 1h RT, MBP 1/100 : 3h RT
4. MBP 1/100, Caspr1 1/100 : 3h RT
5. MBP 1/100, panNF 1/100 : 3h RT
6. MBP 1/100, CNTN1 1/100 : 3h RT
7. MBP 1/100, panNF 1/100 : 3h RT
8. MBP 1/100, CNTN1 1/100 : 3h RT
9. CUBRE: IgG 136-8 1/10 : 1h RT, MBP 1/100, Caspr1 1/100 : 3h RT

• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% o Bloqueo universal sin tritón (1/500):
  • GAH488 IgG (suero) + GAM594 (MBP)
  • GAM488 (MBP) + GAR594 (Caspr1)
  • GAH488 IgG (suero) + GAM594 (MBP)
  • GAM488 (MBP) + GAR594 (Caspr1)
  • GAM488 (MBP) + GAC594 (panNF)
  • RAM488 (MBP) + RAG594 (CNTN1)
  • GAM488 (MBP) + GAC594 (panNF)
  • RAM488 (MBP) + RAG594 (CNTN1)
  • CUBRE: GAH488 IgG (suero) + GAR594 (Caspr1) + GAM647 (MBP)
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con fluoromount

Resultado: siempre permeabilizar con tritón 0,3% para ver el marcaje de MPB (con tritón 0,1% no se ve nada!!)

1. IgG 136-8, MBP: no se ve mielina
2. MBP, Caspr1: no se ve mielina
3. IgG 23-2-656, MBP: se ve bien la mielina pero la IgG de 23-2-656 no marca los paranodos
4. MBP, Caspr1: se ve bien la mielina pero el Caspr1 no marca los paranodos
5. MBP, panNF: no se ve mielina
6. MBP, CNTN1: no se ve mielina
7. MBP, panNF: se ve bien la mielina, y el panNF marca los nodos. Nose porque el verde también marca mucho los nodos!!!
8. MBP, CNTN1: no se ve mielina
9. CUBRE: se ha roto