- Explantes DRG: 2 placas de 24 wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo (1 placa con Poly-D-lys/laminina, y otra con Matrigel)
- D0 (07/09): Añadir 400 ul de medio NG a cada pozo con cubre:
- D1 (8/9): añado 150ul de medio NG (no quito nada del anterior)
- D4 (11/9): quito 300ul de cada pozo y añado 400ul de medio NG nuevo
- D6 (13/9) : quito 300ul de cada pozo y añado 400ul de medio de mielinización NG:
- 50 ug/ml de ácido ascórbico: 500 ul del stock 5mg/ml (1/100 en el medio)
- D8 (15/9): cambiar mitad del medio de mielinización
- A partir de aquí ir cambiando la mitad del medio de mielinización cada 3 días
- Explantes médula: 1 placa de 24 wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo (12w con Poly-D-lys/laminina, y 12w con Matrigel)
- Mismo tratamiento que explantes DRG
- Neuronas DRG: 3 placas 60 cc con 26 cubres 9mm, y 1 placa de 35cc con 6 cubres 9mm.
- D0 (7/9) : Añadir medio NG
- D1 (8/9): cambiar la mitad de medio por medio NGF
- 10 µl de 5-fluorodesoxiuridina (1)
- D4 (11/9): cambiar la mitad de medio por medio NG (las células se han quedado un poco chungas)
- D5 (12/9): cambiar la mitad de medio por pedio NG (para eliminar los restos de medio NGF que puedan haber)
- Ir cambiando la mitad del medio NG cada 2/3 días
- El día 19/09 tiro las neuronas porque no están creciendo
- Células médula disgregadas (con glía): 1 placa 60cc con 26 cubres 9mm:
- Tratadas como explantes de DRG y médula
- Neuronas médula: 2 placas 60 cc con 26 cubres 9mm (tratadas como neuronas DRG con alguna variación)
- D0 (8/9) : Añadir medio NG
- D3 (11/9): cambiar la mitad de medio por medio NGF
- D5 (13/9): cambiar la mitad de medio por medio NG
- D6 (14/9): cambiar la mitad de medio por pedio NG (para eliminar los restos de medio NGF que puedan haber)
- Ir cambiando la mitad del medio NG cada 2/3 días
- Neuronas médula + cels Schwann/C2C12: 3 placas 60 cc con 26 cubres 9mm
- D0 (8/9) : Añadir medio NG
- D3 (11/9): cambiar la mitad de medio por medio NGF
- D5 (13/9): cambiar la mitad de medio por medio NG
- D6 (14/9): cambiar la mitad de medio por pedio NG (para eliminar los restos de medio NGF que puedan haber)
- D7 (15/9): planto células de Schwann y C2C12 en placas de neuronas de médula. Todas con medio C (DMEM, 1%Pen-Str, 10%FBS, 25ul NGF)
- CS humanas: 1 millón de cels en 1 placa de neuronas médula.
- CS primarios rata: 1 millón de cels en 1 placa de neuronas médula. Medio C
- C2C12: 0’1millones cels en 1 placa de neuronas médula (aprox 5000c/cm2)
- D14 (21/9):
- Médula + cels Schwann: cambio la mitad del medio por medio de mielinización NG
- Médula + C2C12: cambio la mitad del medio por medio de diferenciación C2C12 + NGF (DMEM, 1%Pen-Str, 5% Horse serum, 25ul NGF)
- A partir de aquí ir cambiando la mitad del medio de mielinización/diferenciación cada 3 días
