2023.09.07: Co-cultivo de neuronas DRG i células de Schwann (rata)

Día anterior (2023.09.06): Coating placas para co-cultivos y neuronas

Placas:

• Explantes DRG:  2 placas de 24 wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo:
  • 24w con coating Poly-D-lys/laminina
  • 24w con coating matrigel :
• Explantes médula: 2
• Neuronas DRG: 3 placas 60 cc con 26 cubres 9mm, y 1 placa de 35cc con 6 cubres 9mm. Las usaremos para:
  • Neuronas DRG solas
  • Neuronas DRG + cels Schwann humanas (las CS se plantarán más adelante)
  • Neuronas DRG + cels Schwann rata (las CS se plantarán más adelante)
  • Neuronas DRG + cels C2C12 (línea mioblastos ratón): placa 35 cc (las C2C12 se plantarán más adelante)
• Neuronas médula: 6 placas 60 cc con 26 cubres 9mm (el coating de estas placas se hace el día 8/9/23). Las usaremos para:
  • Neuronas médula solas (2 placas)
  • Co-cultivos médula disgregada
  • Neuronas médula + cels Schwann humanas (las CS se plantarán más adelante)
  • Neuronas médula + cels Schwann rata (las CS se plantarán más adelante)
  • Neuronas médula + cels C2C12 (línea mioblastos ratón): las C2C12 se plantarán más adelante

Protocolo coating Poly-D-lys/laminina:

• Coating con Poly-D-lys 1/40 : incubar 1h a 37ºC
• Lavar 1 vez con PBS1x
• Coating con laminina 4 ul/ml: incubar 1h a 37ºC (he augmentado la concentración de laminina)
  • *descongelar la laminina en la nevera o en hielo
• Lavar 1 vez con PBS1x

Protocolo coating Matrigel:

• Preparar el Matrigel 1/10 en DMEM: preparo sólo 1 ml de la dilución (900ul de DMEM y 100ul de Matrigel)
  • *descongelar el matrigel en la nevera o en hielo
• Poner en un pozo y rápidamente quitar la solución para dejar sólo una capa fina.
• Ir pasando el matrigel diluído de un pozo al otro
• No dejar secar los pozos después de pasar el matrigel : añadir medio NG rápidamente

2023.09.07: Co-cultivo de neuronas DRG i células de Schwann (rata)

Se extraen a partir de embriones de rata. Ratas Sprague-Dawley embarazadas.

Se piden ratas E15 pero se utilizan pasadas 24horas : el cultivo se inicia en E16.

Extracción de DRGs

• Estabulario
• Llevar al estabulario un tubo falcon de 50 ml con medio L15 (en hielo) y material instrumental (tijeras, bisturí, pinzas…).

Medio L15:

• 45 ml de medio Leibovitz’s
• 5 ml de FBS (10%)
• Poner el animal a la cámara de CO₂ : abrir la llave hasta el número 2, subir el O₂ hasta el 2, y poner el  isofluorano al 5.
• Sacar la rata de la cámara y ponerla encima de un corcho. Pinchar 1ml de TP41 (Solución inyectable para eutanasia) en el corazón.
• Mojar la rata con alcohol y abrir por debajo (ponerla boca arriba). Tirar de las bolsas de los fetos y ponerlos en una placa con L15.
• Sacar todos los fetos de las bolsas y ponerlos en un tubo con medio L15 (en hielo).
•  
• Cultivos
• Poner todos los fetos en una placa con el medio L15 y mantenerla sobre el hielo.
• Coger un feto, ponerlo sobre la placa con Agar y mojarlo con PBS (estéril y frío, mantenerlo en hielo). Es importante ir mojando el feto con PBS, no puede quedarse seco en ningún momento.
• Cortar la cabeza con unas tijeras y clavar el feto boca abajo con 4 puntas de aguja en las extremidades.
• Sacar las dos capas que envuelven la medula espinal y sacar la médula procurando que no se rompa.
• Sacar los ganglios que se hayan quedado pegados a la médula y pasarlos a una placa pequeña con L15.
• Con una aguja de insulina sacar para fuera los DRG de la columna e irlos pasando a la placa con L15

Co-cultivos (explantes DRG)

• D0 : Añadir 400 ul de medio NG (co-culture medium) a cada pozo con cubre:
  • Medio NG:
    • 48 ml de medio Neurobasal
    • 1 ml de suplement B27
    • 500 µl de glutamax
    • 500 µl de Pen-Str
    • 25 µl de NGF
• Poner un DRG o trocito de médula en cada pozo/cubre e incubar a 37ºC

Neuronas DRG

• Pasar los DRG a un tubo de 15 ml : con pipeta Pasteur de cristal y tetina
• Centrifugar a 300 rpm 5 min
• Eliminar el sobrenadante (con pasteur cristal+ tetina) e ir tirando a una placa, para no perder ningún DRG.
• Poner 5 ml de PBS1x y centrifugar a 300 rpm 5 min
• Eliminar el sobrenadante y añadir 4,5 ml PBS + 500 ul de tirpsina 2,5% sin bromophenol
• Incubar 15min a 37ºC (en el baño). Homogeneizar suavemente cada 5 minutos.
• Añadir 5 ml de medio L15 con FBS para inactivar la tripsina
• Centrifugar a 300 rpm 10min
• Pasar el pellet a un eppendorf con 1 ml de medio NG, disgregar con pipetas Pasteur de vidrio finas (se hacen finas con el bunsen y se autoclavan).
• Dividir el ml de células entre 3 placas 60 cc con 26 cubres 9mm, y 1 placa de 35cc con 6 cubres 9mm.

*Guardo en  MACS Tissue  Storage Solution (130-100-008, Milteny) las médulas de 10 embriones y las dejo en 4ºC hasta el día siguente.