2023.08.16: ICC co-cultivos (día 26 – rata 20/07/2023)

Cojo cubres de todas las condiciones para ir viendo cómo va la diferenciación.

Protocolo:

• Fijar 20 min con PFA 4%
• 1 lavado con PBS1x
• Bloquear con Goat serum 5% y 0’5% tritón (en PBS): 1h a RT
• Incubar con anticuerpos primarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón  (en PBS):
  • MBP y NFh
    • anti-Myelin basic protein SMI99, 808401 (Biolegend). Dil. 1/100 (mouse): overnight 4ºC
    • anti-Neurofilament H, AB5539 (Merck) Dil. 1/500 (chicken): 1h RT
• 3 lavados con PBS1x
• Incubar 1h con Ac. secundarios diluídos en Goat serum 5% y 0’5% tritón (todos a 1/500)
  • MBP y NFh: GAM488 + GAC594
• 3 lavados con PBS1x
• Montar con Fluoromount

Resultado: en general elNFh marca muy bien. MBP marca cosas que no son mielina. Creo que el GAM488 tiene precipitados. No hago fotos porque se ve todo muy mal.

1. Explante DRG 01/06/23
2. Explante médula 01/06/23
3. Médula disgregada 20/07/23 (tratada como co-cultivos): quizás sí que hay un poco de mielina
4. Explante DRG coating habitual 20/07/23 (Poly-D/laminina)
5. Explante DRG matrigel 20/07/23
6. DRG cels disgregadas matrigel 20/07/23: no se ve nada porque hay muchas capas de células