2023.07.21: Cambios medios co-cultivos, neuronas DRG y neuronas médula (rata 20/07/2023)

Pongo el protocolo general para no tener que ir poniendo cada vez que cambio los medios:

• Explantes DRG:  1 placa de 24 wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo, y 6 culture slides
  • D0 : Añadir 400 ul de medio C (co-culture medium) a cada pozo con cubre:
    • DMEM (con D-glucosa y Glutamax): 44,5 ml (ref. 10569-010 ThermoFisher)
    • 10% FBS: 5 ml
    • 1% Pen-Str: 0,5ml
    • 50 ng/ml NGF: 25 ul
  • D1: cambiar la mitad del medio (medio C)
  • D4 : cambiar el medio por medio NG:
    • Neurobasal: 48 ml
    • 2% B27: 1 ml
    • 1% L-glutamina (en este caso, Glutamax): 0,5 ml
    • 1% Pen-Str: 0,5 ml
    • 50 ng/ml NGF:25 ul
  • D7 : cambiar el medio por Medio de mielinización co-cultivos SIN FBS:
    • DMEM (con D-glucosa y Glutamax): 44,5 ml (ref. 10569-010 ThermoFisher)
    • 10% FBS: 5 ml
    • 1% Pen-Str: 0,5ml
    • 50 ug/ml de ácido ascórbico: 500 ul del stock 5mg/ml (1/100 en el medio)
    • 0,5 uM Forskolin: 2,5ul del stock 10mM (1/20000 en el medio)
  • D8: cambiar mitad del medio de mielinización: a partir de aquí ir cambiando la mitad del medio de mielinización sin FBS cada 3 días
• Explantes DRG MATRIGEL:  1 placa de 24 wells con 1 cubre de 12mm en cada pozo : hago 12w con DRG disgregadas, y 12w con explantes
  • Se tratan igual que los explantes DRG normales
  • Voy mirando los cultivos y me parece que están más bonitos los del coating de matrigel (células más pegadas, axones más largos): a medida que pasan los días, las células de DRG disgregadas crecen demasiado y es imposible ver nada en las immunos)
• Neuronas DRG: 4 placas 100 cc (para IP) y 1 placa 60 cc con 26 cubres 9mm
  • D0 : Añadir medio NG
    • 48 ml de medio Neurobasal
    • 1 ml de suplement B27
    • 500 µl de glutamax
    • 500 µl de Pen-Str
    • 25 µl de NGF
  • D1: cambiar la mitad de medio por medio NGF
    • 50 ml de medio NG
    • 10 µl de 5-fluorodesoxiuridina (1)
    • 10 µl de uridina (2)
    • 5 µl de AraC 10 mM
  • D4: cambiar la mitad de medio por pedio NG : a partir de aquí ir cambiando cada 2-3 días
• Neuronas médula: 2 placas 60 cc con 26 cubres 9mm : una placa la hago con sólo neuronas (tratadas como neuronas DRG), y otra con todas las células (tratadas como co-cultivos)